NR2B在氯化锂—匹罗卡品癫痫大鼠模型中痫性发作机制的研究

论文摘要

第一部氯化锂—匹罗卡品致癫痫动物模型药物剂量比较与分析目的:建立氯化锂-匹罗卡品化学诱大鼠癫痫模型时,寻求降低死亡率同时提高造模成功率的合理用药方法。方法:雄性Wistar大鼠69只,依照使用氯化锂剂量（mg/kg）/匹罗卡品剂量（mg/kg）及止痉剂的不同随机分为以下四组:Ⅰ:125/10/水合氯醛组,Ⅱ:135/20/水合氯醛组,Ⅲ:125/30/水合氯醛组及Ⅳ:135/20/安定组。氯化锂腹腔注射后18—20h后给予阿托品1 mg/Kg,半小时后按照不同组别给予匹罗卡品,癫痫持续状态1小时后给予安定或水合氯醛终止发作。结果:实验大鼠匹罗卡品腹腔注射后,动物均有不同程度的胆碱能反应,继之出现面部抽搐、咀嚼、头部阵挛,逐渐发展至双前肢阵挛或全身强直阵挛发作等不同级别癫痫发作表现,发作达Ⅳ级以上超过30 min为癫痫持续状态（statusepilepticus,SE）。癫痫状态后1小时后依照方案给予不同止痉剂,30 min内如未停止发作,可原半剂量重复注射,必要时8小时后重复注射。4d—20d的潜伏期,主要表现为精神萎靡、进食活动少、消瘦,但无自发癫痫发作。21d～60d慢性期,80%左右的大鼠出现自发发作,开始多为局部性,进而发展至全身强直阵挛发作,一般持续时间为20s-1min,发作均可自行终止。匹罗卡品腹腔注射6.05 min±4.07 min开始出现症状,22.31 min±5.99 min出现癫痫的Ⅳ级及其以上的发作,各组间无统计学意义,但经水合氯醛与安定终止癫痫发作的时间有显著差异（P＜0.05）,分别为10.14min±5.32min,23.41min±5.56min。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组的造模成功率及死亡率两两比较有显著差异（P＜0.05）,Ⅱ组的造模成功率最高（85%）,死亡率最低（23.5%）。Ⅱ组与Ⅳ组统计学比较结果无差异（P＞0.05）,但病死率的数据提示水合氯醛止痉效果较安定较好。大鼠的死亡率与匹罗卡品的累计用量成正向直线相关（Pesrson相关分析,P=0.839）。结论:推荐使用135/20剂量的氯化锂-匹罗卡品腹腔注射,同时联合应用水合氯醛止痉,可提高造模成功率,保证存活大鼠的数量。第二部艾芬地尔对癫痫大鼠脑电图的影响目的:观察艾芬地尔干预氯化锂-匹罗卡品致痫大鼠的脑电图随时间变化特征,探讨其对癫痫大鼠脑电的影响。方法:90只雄性Wistar大鼠分为3组:对照组、模型组和艾芬地尔干预组,每组30只大鼠,通过腹腔注射氯化锂-匹罗卡品建立癫痫动物模型,根据1、3、7、15、30和60d不同时间点观察脑电图变化,每时间点5只大鼠。结果:对照组无痫性发作。干预组较模型组痫性放电的潜伏期延长、痫波发放频率及波幅降低,减轻了痫性发作,且两组间存在统计学差异（P＜0.01）。两组脑电图显示在不同时间点各频段波所占比例及波形有特征性改变。潜伏期干预组及模型组的波幅及频率骤然减低,慢性期干预组较模型组的波幅逐渐增高,频率逐渐增快,更早更快趋于正常化。结论:1、模型组痫性发放,脑电图是有阶段性及规律性。2、艾芬地尔抑制了痫性放电的波幅及频率,且使背景波趋于正常化,可作为基础的抗癫痫药物之一。第三部分致痫大鼠海马NR2B、GAP-43、GFAP及Timm染色的表达规律目的:观察NR2B、GAP-43及GFAP在颞叶癫痫中的表达规律,探讨癫痫反复发作及突触重建的机制。方法:140只体重为180～250克健康雄性成年Wistar大鼠,随机分成对照组和模型组。采用氯化锂-匹罗卡品腹腔注射造模,分别在癫痫发作后的预定时间点取材,通过HE染色和免疫组织化学方法观察海马结构区神经元的存活情况、NR2B、GFAP和GAP-43的表达变化规律;Timm染色法检测海马结构内的苔藓纤维出芽情况。结果:1、NR2B在SE发作后1h时的各区的着色均增强,6h时达高峰,2d时降低,7d时表达最低,15d逐渐升高,直至2月。CA1区表达高于CA3区,齿状回的表达最低。2、GFAP的表达规律与NR2B在时空上表达一致。30d-60d在CA1区形成胶质结节。且在CA1区神经元细胞的脱失与二者均存在负相关性。CA1区胶质细胞的光密度表达与神经元的存活数Spearman相关分析,相关系数R=-0.826,P=0.000,;NR2B在CA1区与神经元的存活数的Spearman相关系数R=-0.73,P=0.000。3、GAP-43蛋白在癫痫发作早期降低,在CA1、CA3区在2d时表达最低,在齿状回7d时最低,然后升高。4、苔藓纤维出芽在7d后逐渐增多,并与门区的神经元的存活呈负相关。GAP-43蛋白光密度的表达规律与早期与神经元的脱失有关,晚期与MFS有关。随癫痫反复的发生,异常的MFS也逐渐加重,7d后模型组与对照组存在统计学差异（P＜0.01）。结论:NR2B受体是参与癫痫发作的机制之一。在癫痫发生过程中减少神经细胞的死亡和胶质细胞的增生,抑制NR2B的表达和苔藓纤维的出芽,抑制形成异常的神经网络,为临床治疗癫痫提供一条新的途径,故对药物的开发提供一个方向。第四部艾芬地尔对致痫大鼠海马突触重建的影响目的:探讨艾芬地尔在癫痫发作中的神经保护作用及对突触重建的影响。方法:雄性成年Wistar大鼠210只,随机分成3组:对照组、模型组、艾芬地尔药物干预组。分别于造模前1周每日用药物或生理盐水腹腔注射进行预处理后制作癫痫模型,造模成功后继续干预治疗,分别按照不同的指标和监测项目设定的时间点分别监测并处死大鼠取材。通过观察比较海马结构区神经元的的存活和苔藓纤维发芽的情况和NR2B、GFAP和GAP-43在各组的表达规律。结果:1、神经元的存活情况:干预组与模型组神经元存活数在CA1区各时间点均存在统计学差异（CA1区1h和15d时P＜0.05,其余时间点P＜0.01）。门区1h、6h、2d和7d均无统计学差异,其余时间点存在统计学差异（15d时P＜0.05,30d及60d时P＜0.01）。2、NR2B的表达规律:干预组与模型组的表达规律基本相似。CA1区表达高于CA3区,齿状回的表达最低。两组在CA1区15d无统计学差异,其余时间点均存在统计学差异（P＜0.01）。在CA3区1h、15d无统计学差异,其余时间点有统计学差异（P＜0.01）。3、GFAP阳性细胞的染色结果:干预组与模型组表达规律相似,但干预组在CA1、CA3区未形成胶质结节。两组在门区1h无统计学意义,但在其余时间点均存在统计学差异（15d、30d时P＜0.05,其余时间点P＜0.01）。CA1区2d时两者之间无统计学差异,其余时间点均存在统计学差异（7d时P＜0.05,其余时间点P＜0.01）。4、GAP-43的表达规律:干预组GAP-43蛋白的表达与模型组的表达恰相反,且与模型组的表达强度比较,在CA3区60d无统计学差异,其余时间点均存在统计学差异（P＜0.01）,门区均存在统计学差异（30d时P＜0.05,其余时间点P＜0.01）。齿状回内分子层的GAP-43蛋白的光密度与门区的神经元存活数呈二次曲线拟合。5、Timm染色结果:干预组与模型组在门区和CA3区不同时间点苔藓纤维发芽比较两者之间均无统计学差异。干预组与模型组苔藓纤维发芽与门区神经元的存活数目之间均存在负相关（Spearman相关分析,相关系数R分别为-0.791,-0.891,P均为0.000）。结论:1、艾芬地尔减轻了癫痫发生中神经元的损伤,减少了神经细胞的死亡。2、艾芬地尔抑制了NR2B的表达,具有抗癫痫作用。3、艾芬地尔抑制了GFAP的表达,减轻胶质细胞的增生,抑制了胶质结节的形成。4、艾芬地尔促进了GAP-43蛋白的表达,其在抗癫痫机制中的意义应进一步研究。5、艾芬地尔对MFS无作用。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 材料和方法
• 第一部 氯化锂—匹罗卡品致癫痫动物模型药物剂量比较与分析
• 引言
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第二部 艾芬地尔对癫痫大鼠模型脑电图的影响
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第三部 NR2B、GAP-43、GAP-43及Timm染色在致痫大鼠海马的表达规律
• 引言
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第四部分 艾芬地尔对致痫大鼠海马突触重建的影响
• 引言
• 结果
• 讨论
• 结论
• 实验小结
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的论文目录
• 致谢
• 缩略词表
• 附实验图片