论文摘要
[背景和目的]原发性肝癌（简称肝癌）是指由肝细胞或肝内胆管上皮细胞发生的恶性肿瘤。我国每年约有11万人死于肝癌,占全球肝癌死亡人数的45%,已成为世界上肝癌发病最集中的国家。目前,治疗肝癌的方法很多。手术被认为是治疗早期肝癌最有效的方法,但术后复发和转移率很高,预后较差。放疗及全身化疗对大部分肝癌的疗效不甚理想,不论是单药还是联合化疗,肝癌对大多数常规化疗药物反应不佳,其有效率仅在10%～20%。近年来,肝癌介入治疗—肝动脉栓塞化疗（TACE）因其具有靶向性,所以药物作用部位精确、肿瘤局部药物浓度高、疗效显著,已经成为中晚期及手术后复发的肝癌病人的首选。但是,介入治疗也存在不足,介入治疗中多采用传统的化疗药物,毒副作用较大,在杀伤肿瘤细胞的同时,正常细胞也受到很大损害,而且肿瘤细胞对化疗药物易产生耐药性,使其在临床上的应用受到很多限制。因此,寻找高效、低毒副作用的新型抗癌药物成为目前医学领域研究的重要课题之一。茉莉酸甲酯（MeJA）是新型植物激素一茉莉酸的甲基衍生物,是茉莉酸类（JAs）激素的主要代表之一。茉莉酸广泛存在于植物界,分布于植物体的各种组织器官尤其是维管束中,具有植物激素的多效作用,能够在植物体中诱导若干起防护作用的基因表达,是伤害反应中的重要信号分子。文献对于茉莉酸甲酯的报道大多限于林学等植物学领域的研究,但其抗肿瘤作用的研究报道甚少。研究发现,茉莉酸甲酯作为一种植物激素不仅能够调节植物的应激反应,而且对哺乳类动物肿瘤细胞也有杀伤作用。茉莉酸甲酯能否具有抑制HepG2人肝癌细胞增殖、诱导凋亡作用,国内外未见文献报道。因此,本研究通过体内外实验研究,从整体、细胞和分子水平上观察茉莉酸甲酯对HepG2人肝癌细胞抑制增殖、诱导凋亡的作用,探讨其可能的作用机制,为茉莉酸甲酯抗肝癌作用的研究奠定一定的理论和实验依据。[方法]1.体外培养HepG2细胞,MTT法进行茉莉酸甲酯有效作用浓度筛选,确定MeJA工作浓度(1/2 IC50),检测细胞线粒体呼吸功能变化:倒置显微镜及HE染色观察各组细胞形态变化;采用放射免疫法检测细胞和裸鼠外周血甲胎蛋白（AFP）变化;应用透射电镜观察细胞超微结构;流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡;琼脂糖凝胶电泳（DNA Ladder）检测细胞凋亡。2.应用RT-PCR检测细胞和裸鼠瘤体中Bcl-2、Bax、Caspase-3、hTERT、p53、p21和p16mRNA表达;免疫细胞化学及免疫组织化学检测细胞和裸鼠瘤体中Bcl-2、Bax、Cyclin D1、AFP、p53、Ki-67和端粒酶蛋白表达。3.激光共聚焦扫描显微镜检测细胞线粒体膜电位变化;蛋白印迹法检测细胞线粒体及胞浆中细胞色素C的表达。4.建立人肝癌裸小鼠皮下移植瘤模型。裸鼠成瘤情况观察、测量;计算肿瘤生长抑制率;HE染色光镜组织形态学观察裸鼠肿瘤组织形态学变化及裸鼠心、肝、脾、肺、肾、胰腺组织的病理形态学变化。5.实验分为四组:（1）对照组;（2）MeJA组;（3）ATRA组:（4）MeJA+ATRA组。[结果]第一部分结果:1.不同浓度MeJA作用不同时间对HepG2细胞增殖的抑制作用结果显示:0.01μmol/L、0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L、100μmol/LMeJA作用24h、36h、48h、72h后,HepG2细胞增殖呈时-效和量-效依赖关系。2.MeJA作用不同时间的半数抑制浓度IC50为8.60μmol/L。以MeJA作用于HepG2细胞48h后IC50的1/2,即4.3μmol/L作为后续实验中MeJA的工作浓度。3.MeJA对HepG2细胞生长抑制作用的形态学观察结果显示:对照组细胞贴壁生长良好;HE染色见细胞着色不均匀,细胞呈叠瓦状排列处着色较深。MeJA处理组见有部分细胞脱落,贴壁细胞数量明显减少;HE染色,细胞着色较均匀。ATRA处理组也可见部分细胞脱落,贴壁细胞数量减少,HE染色,细胞核深染,部分细胞收缩变小、变圆。MeJA+ATRA联合处理组:贴壁细胞数量明显减少,HE染色,细胞着色均匀一致。4.MeJA对HepG2细胞作用的透射电镜超微结构观察显示:对照组48hHepG2细胞分化低,为典型恶性肿瘤细胞的形态特征。MeJA组部分细胞出现细胞连接消失,微绒毛消失,见凋亡小体。ATRA组部分细胞见核分裂像和细胞凋亡改变。MeJA+ATRA组部分线粒体肿胀,细胞微绒毛消失,可见凋亡小体。5.MeJA对HepG2人肝癌细胞周期作用的流式细胞结果显示:对照组G1期细胞比例为40.8%,S期细胞比例24.6%,而G2期细胞比例为34.6%。MeJA组细胞周期发生明显的G1期阻抑,G1期细胞比例由40.8%上升为62.1%,而S期细胞则由24.6%下降为17.3%;G2期细胞比例则由34.6%下降到20.6%,细胞周期被阻滞于G1期;有部分细胞出现凋亡,可见亚二倍体峰。ATRA组G1期细胞比例有所增加,占55.9%;S期细胞比例有所减少,为17.2%,G2期细胞比例亦较少,为26.9%;细胞明显被阻滞于G1期。MeJA+ATRA联合处理组细胞出现G1期阻抑比较显著,G1期细胞比例高达61.2%,S期细胞显著减少,仅为7.1%,G2期细胞比例略有所增加,为31.7%;大多数细胞被阻滞于G1期,即细胞以发生G1期阻滞效应为主,同时也发生一定的G2/M期阻滞效应,但仍以G0/G1期阻滞为主,而且其G0/G1期阻滞效应比MeJA及ATRA单独处理要强,可见典型凋亡二倍体峰。6.MeJA诱导HepG2细胞凋亡作用的DNA琼脂糖凝胶电泳结果显示:对照组未见有DNA断裂梯状带;MeJA组、ATRA组、及MeJA+ATRA组48hHepG2细胞,均可见明显典型“梯”状条带,条带间隔为180bp～200bp及其整数倍。第二部分结果:1.MeJA对HepG2细胞内Bcl-2、Bax、Caspase-3、hTERT、p53、p21、p16mRNA表达的影响①Bcl-2和Bax mRNA琼脂糖凝胶电泳结果显示:对照组HepG2细胞内Bcl-2及Bax mRNA存在一定量表达;MeJA、ATRA和MeJA+ATRA作用48h后Bcl-2 mRNA表达水平均明显下降（P＜0.05）,而Bax mRNA表达水平明显高于对照组（P＜0.05）。②p53,Caspase-3和hTERT mRNA琼脂糖凝胶电泳结果显示:对照组HepG2细胞内p53,Caspase-3和hTERT mRNA均存在一定量表达;MeJA组、ATRA组及MeJA+ATRA组作用HepG2细胞48h后,各组p53 mRNA表达水平均明显低于对照组（P＜0.01）;MeJA组、ATRA组及MeJA+ATRA组各组间比较均有差异（P＜0.05）。MeJA组、ATRA组及MeJA+ATRA组作用HepG2细胞48h后,各组Caspase-3 mRNA表达水平均有不同程度增强,MeJA+ATRA组高于对照组及ATRA组（P＜0.05）。MeJA组、ATRA组及MeJA+ATRA组作用HepG2细胞48h后,各组hTERT mRNA表达水平均明显低于对照组（P＜0.05）;MeJA组、MeJA+ATRA组低于ATRA组（P＜0.05）。③p16和p2lmRNA琼脂糖凝胶电泳结果显示:MeJA组及MeJA+ATRA组作用HepG2细胞48h后,p16mRNA表达水平均明显高于对照组（P＜0.05）:MeJA组及MeJA+ATRA组p16 mRNA表达水平高于ATRA组（P＜0.05）。各处理组p21 mRNA表达水平均明显高于对照组（P＜0.05）;MeJA组及MeJA+ATRA组p21mRNA表达水平高于ATRA组（P＜0.05）。2.MeJA对HepG2细胞内Bcl-2、Bax、CyclinD1、p53、Ki-67和端粒酶蛋白表达的影响①Bcl-2和Bax蛋白免疫细胞化学检测结果表明:MeJA组、ATRA组及MeJA+ATRA组作用HepG2细胞48h后,各组Bcl.2蛋白在胞浆中表达水平均明显低于对照组（P＜0.01）;ATRA组与MeJA组、MeJA+ATRA组比较,Bcl-2蛋白表达差异显著（P＜0.01）。MeJA组、ATRA组及MeJA+ATRA组作用后,Bax蛋白表达水平较均对照组显著增加（P＜0.01）;MeJA组和MeJA+ATRA组Bax蛋白表达高于ATRA组（P＜0.01）。②cyclinD1和p53蛋白免疫细胞化学检测结果表明:MeJA组、ATRA组及MeJA+ATRA组作用HepG2细胞48h后,各组cyclinD1蛋白表达水平均明显低于对照组（P＜0.01）:MeJA组、MeJA+ATRA组cyclinD1蛋白表达低于ATRA组（P＜0.05）。MeJA组、ATRA组及MeJA+ATRA组作用HepG2细胞48h后,各组p53蛋白表达水平均低于对照组（P＜0.01）:MeJA组和ATRA组p53蛋白表达水平高于MeJA+ATRA组（P＜0.01）;MeJA组p53蛋白表达水平低于ATRA组（P＜0.05）。③Ki-67和端粒酶蛋白免疫细胞化学检测结果表明:MeJA组、ATRA组及MeJA+ATRA组作用48h后,各组Ki-67蛋白表达水平均低于对照组（P＜0.01）:MeJA组、MeJA+ATRA组Ki-67蛋白表达低于ATRA组（P＜0.05）;MeJA组与ATRA组之间相比较,差异显著（P＜0.01）。MeJA组及MeJA+ATRA组作用HepG2细胞48h后,端粒酶蛋白表达水平均低于对照组（P＜0.01）;ATRA组端粒酶蛋白表达低于对照组（P＜0.05）;ATRA组端粒酶蛋白表达高于MeJA组（P＜0.01）而MeJA+ATRA组端粒酶蛋白表达低于MeJA组（P＜0.01）:MeJA+ATRA组端粒酶蛋白表达低于ATRA组（P＜0.01）。第三部分结果:1.MeJA对HepG2肝癌细胞线粒体呼吸功能的MTT实验结果表明:MeJA组、ATRA组、MeJA+ATRA组作用HepG2细胞48h后,HepG2细胞线粒体呼吸功能水平较对照组明显下降（P＜0.05）。2.MeJA对HepG2肝癌细胞凋亡作用的流式细胞术结果显示:对照组凋亡发生比率为13.1%,ATRA组凋亡发生比率为36.3%,MeJA组凋亡发生比率为41.5%,MeJA+ATRA组凋亡发生比率为43.9%,以MeJA+ATRA组作用后,HepG2细胞发生凋亡比率最强,3.MeJA对HepG2肝癌细胞线粒体膜电位影响的激光共聚焦显微镜实验结果表明:MeJA组、ATRA组、MeJA+ATRA组作用HepG2细胞48h后,细胞线粒体跨膜电位较对照组显著下降（P＜0.01）;但三个处理组间相比,差异无统计学意义（P＞0.05）。4.MeJA对HepG2肝癌细胞线粒体和胞浆中细胞色素C蛋白表达的影响Western blot结果显示:48hHepG2细胞线粒体中细胞色素C在对照组中表达较强,而MeJA组、ATRA组、MeJA+ATRA组表达较弱;胞浆中细胞色素C在对照组中表达较弱,而MeJA组、ATRA组、MeJA+ATRA组细胞色素C表达在胞浆中明显增强。第四部分结果:1.MeJA对HepG2细胞裸鼠皮下移植瘤生长抑制作用的结果显示:全部裸鼠体表淋巴结及腹腔淋巴结未见转移,亦未见腹膜转移及腹水;MeJA组、ATRA组及MeJA+ATRA组作用后HepG2细胞移植瘤体积和瘤重明显小于对照组,有显著差异（P＜0.01）;MeJA+ATRA组肿瘤抑制率最高,MeJA组次之,ATRA最低,但三组间相比较无统计学意义（P＞0.05）。2.病理组织形态学HE染色结果显示:肿瘤组织中,细胞特点与原细胞株基本一致。MeJA、ATRA、MeJA+ATRA三个处理组,肿瘤组织发生改变情况相似,均出现瘤组织中癌细胞密度减少,伴纤维化改变,部分癌巢发生程度不等片状坏死。各组裸鼠心、肝、脾、肺、肾、胰腺组织,亦均未见转移灶。3.荷瘤裸鼠外周血甲胎蛋白放免法测定结果显示:各处理组与对照组比较AFP值均有明显降低（P＜0.01）。4.MeJA对裸鼠瘤体中Bcl-2、Bax、Caspase-3、hTERT、p53、p21和p16mRNA表达的影响（1）MeJA组、ATRA组、MeJA+ATRA组肿瘤组织中Bcl-2 mRNA表达水平较对照组明显下降（P＜0.05）,而Bax mRNA表达明显增加（P＜0.05）。（2）MeJA组、MeJA+ATRA组Caspase-3 mRNA表达水平较对照组明显增加（P＜0.05）,MeJA组和MeJA+ATRA组比ATRA组表达增高（P＜0.05）。MeJA组、ATRA组及MeJA+ATRA组hTERT mRNA表达水平较对照组明显降低（P＜0.05）,MeJA组和MeJA+ATRA比ATRA组增高（P＜0.05）。（3）MeJA组、ATRA组及MeJA+ATRA组p53 mRNA表达水平均明显低于对照组（P＜0.05）,MeJA组及MeJA+ATRA组p53 mRNA表达比ATRA组降低（P＜0.05）。MeJA组及MeJA+ATRA组p21mRNA表达水平较对照组明显增强（P＜0.05）,MeJA+ATRA组p21mRNA表达水平比ATRA组增强（P＜0.05）。MeJA组、ATRA组及MeJA+ATRA组p16mRNA表达水平均较对照组明显增强（P＜0.05）。5.MeJA对裸鼠瘤体中Bcl-2、Bax、Cyclin D1、AFP、p53、Ki-67和端粒酶蛋白表达的影响（1）免疫组织化学Bcl-2和Bax蛋白检测结果表明:MeJA组、ATRA组及MeJA+ATRA组Bcl-2蛋白表达水平均较对照组明显降低（P＜0.05）;三个作用组间相比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。MeJA组、ATRA组及MeJA+ATRA组Bax蛋白表达水平均较对照组明显增加（P＜0.05）:三个作用组间相比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。（2）免疫组织化学Cyclin D1和AFP蛋白检测结果表明:MeJA组、ATRA组及MeJA+ATRA组Cyclin D1蛋白表达水平均较对照组明显降低（P＜0.01）:MeJA+ATRA组Cyclin D1蛋白表达较MeJA组降低（P＜0.05）,较ATRA组相比,差异显著（P＜0.01）。MeJA组、ATRA组及MeJA+ATRA组AFP蛋白表达水平均较对照组明显降低（P＜0.01）:三个处理组间相比较:MeJA组及MeJA+ATRA组分别与ATRA组相比,差异显著（P＜0.01）。（3）免疫组织化学p53、ki-67和Telomerase蛋白检测结果表明:MeJA组、ATRA组及MeJA+ATRA组p53、ki-67和Telomerase蛋白表达水平均较对照组明显降低（P＜0.01）;ATRA组及MeJA+ATRA组p53蛋白表达比MeJA组高（P＜0.05）。MeJA+ATRA组比MeJA组和ATRA组ki-67蛋白表达水平均降低（P＜0.01）。MeJA+ATRA组比MeJA组和ATRA组Telomerase蛋白表达水平均降低（P＜0.01）。[结论]1.不同浓度MeJA作用不同时间对HepG2细胞增殖具有明显的抑制作用,呈时-效和量-效依赖关系。2.MeJA能够使HepG2细胞存活数量减少,抑制HepG2细胞的增殖,发生G0/G1期阻滞,S期细胞数量显著减少,降低HepG2细胞甲胎蛋白含量,具有抑制HepG2细胞增殖作用。3.MeJA能够改变HepG2细胞的超微结构,出现典型的凋亡形态学变化,具有诱导HepG2细胞凋亡的作用。4.MeJA对抑制HepG2细胞增殖和诱导细胞凋亡的作用强于ATRA。5.MeJA与ATRA联合作用在抑制HepG2细胞增殖和诱导细胞凋亡方面具有一定的相加作用。6.MeJA抗肝癌作用的机制可能是从转录及翻译两个水平上发挥作用。7.通过降低细胞周期调控相关基因蛋白CyclinD1、Ki-67、mtp53的表达,上调p16和p21mRNA表达,导致肿瘤细胞周期发生阻滞,从而抑制肝癌细胞增殖。8.通过降低抑凋亡相关基因Bcl-2 mRNA及蛋白的表达,上调促凋亡相关基因BaxmRNA及蛋白的表达,激活Caspase-3,引发凋亡级联反应;抑制hTERTmRNA表达,降低端粒酶蛋白活性,诱导肿瘤细胞发生凋亡。9.MeJA能够使HepG2人肝癌细胞线粒体呼吸功能和线粒体跨膜电位下降,导致细胞线粒体内的细胞色素C释放入细胞浆,激活Caspase级联反应,引起HepG2肝癌细胞凋亡。10.MeJA改变HepG2细胞线粒体功能可能是其抗肝癌作用的一个重要机制。11.MeJA能够使HepG2细胞移植瘤体积缩小,重量减轻,对HepG2肝癌细胞裸鼠皮下移植瘤增长具有较强的抑制作用。12.MeJA能够使裸鼠移植瘤癌细胞密度减少,部分癌巢发生程度不等片状坏死,抑制HepG2细胞移植瘤的生长。13.MeJA对荷瘤裸鼠心、肝、脾、肺、肾、胰腺组织形态结构无明显影响。14.MeJA能够降低荷瘤裸鼠外周血AFP含量和肿瘤组织AFP表达,具有使肝癌细胞恶性表型发生逆转的作用。15.MeJA抑制荷瘤裸鼠肿瘤生长的作用机制可能是通过降低细胞周期调控相关基因蛋白CyclinD1、Ki-67、mtp53的表达,上调p16和p21mRNA表达,导致肿瘤细胞周期发生阻滞,从而抑制肝癌细胞增殖;通过降低抑凋亡相关基因Bcl-2mRNA及蛋白的表达,上调促凋亡相关基因BaxmRNA及蛋白的表达,激活Caspase-3,引发凋亡级联反应;抑制hTERT mRNA表达,降低端粒酶蛋白活性,诱导肿瘤细胞发生凋亡。16.MeJA在诱导肝癌细胞凋亡方面,效果优于ATRA,MeJA和ATRA联合应用与单一药物作用相比,具有一定的相加作用。17.MeJA有望成为一种低毒、高效、新型天然植物激素类抗癌药物。
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