论文摘要
目的通过分子生物学技术,获取细粒棘球蚴（Echinococcus granulosus, Eg）P-29重组蛋白,进行实验动物免疫保护性及其免疫机制的研究,以鉴定其疫苗的潜质。方法（1）细粒棘球蚴诊断抗原P-29基因（EgP-29）的克隆及序列分析:①以细粒棘球蚴原头蚴RNA为模板,根据互联网GenBank检索出EgP-29基因序列设计引物,采用RT-PCR扩增目的基因;将目的基因克隆到pGEM-T载体,转化入大肠杆菌JM109,对EgP-29基因进行克隆及DNA测序;②应用DNAstar、Biosun生物分析软件对EgP-29蛋白的二级结构、抗原表位、三维结构进行预测,应用NCBI/BLAST公共数据库对目的蛋白进行同源性比较分析;（2）重组表达质粒的构建、表达及免疫学特性鉴定:①将目的基因亚克隆到pET-28a表达载体,转化入大肠杆菌BL21（DE3）plysS,诱导表达重组蛋白EgP-29（rEgP-29）,经含Ni2+的His-bind树脂柱纯化rEgP-29;②用rEgP-29免疫小鼠得到抗血清,通过Western-blot及ELISA对rEgP-29的免疫学特性进行研究。（3）rEgP-29诱导小鼠的免疫保护力及其机制研究:①rEgP-29诱导小鼠的免疫保护力观察;②rEgP-29诱导小鼠T淋巴细胞亚群变化的研究;③rEgP-29诱导小鼠细胞因子变化的研究及MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖情况。结果（1）:①通过RT-PCR技术成功扩增目的片段,该基因开放阅读框长度为717bp,构建基因工程菌株EgP-29/pGEM-T/JM109。②EgP-29基因测序结果与GenBank中已发表的基因序列相比同源性为100%,氨基酸序列同源性亦为100%。DANstar软件分析EgP-29分子量约27kDa,极性氨基酸数目68个,转角和不规则卷曲二级结构占21%,Biosun软件分析其抗原表位位点15个。（2）:①构建基因工程菌株EgP-29/pET-28a/BL21（DE3）plysS,表达并纯化出分子量约31kD的rEgP-29。②初步鉴定rEgP-29的免疫学特性:Western-blot检测结果显示,rEgP-29免疫小鼠的抗血清可识别rEgP-29、天然抗原原头蚴;细粒棘球蚴感染的兔抗血清也可以识别rEgP-29。ELISA结果显示,免疫组血清中的吸光度值明显高于对照组血清（P<0.01）。（3）:①rEgP-29能诱导小鼠产生96.6%的免疫保护力,rEgP-29组小鼠在抗原免疫后和攻击感染后均产生高水平的IgG、IgG1和IgG3抗体,低水平的IgG2a和IgE,IgG2b水平在攻击前是升高的,在攻击后是降低的,提示IgG、IgG1、IgG3u可能参与保护性的免疫应答机制。②rEgP-29组小鼠在攻击感染后不仅CD4+T细胞增加,CD8+T细胞也有轻度增加,CD4+/CD8+比值与PBS对照组比较有所降低。③rEgP-29组小鼠在攻击感染后产生高水平的IL-2,低水平的IL-4和IFN-γ,提示该重组抗原以诱导Th1型免疫应答为主的反应;同时攻击感染后进行脾淋巴细胞增殖试验,MTT法检测证实rEgP-29免疫的小鼠在rEgP-29刺激下脾淋巴细胞增殖水平明显高于PBS对照组（P<0.01）。结论（1）:成功扩增中国大陆株细粒棘球蚴诊断抗原P-29基因,构建基因工程菌株EgP-29/pGEM-T/JM109。EgP-29结构、功能及抗原表位的预测对本实验的实施及选取有价值的抗原肽段提供了理论依据。（ 2 ）:成功构建基因工程菌株EgP-29/pET-28a/BL21（DE3）plysS,表达并纯化出rEgP-29。经免疫学鉴定初步说明:rEgP-29有较好的抗原性及免疫原性,具有抗包虫病疫苗候选分子的潜能。（3）:rEgP-29能诱导小鼠产生部分免疫保护力,其保护性免疫主要通过诱导宿主产生体液免疫应答和Th1型免疫应答,表明rEgP-29是具有发展前途的抗包虫病候选疫苗。