鼻咽癌细胞中“c-Myc/miRNA/靶基因”交互作用分子网络的初步构建及功能研究

鼻咽癌细胞中“c-Myc/miRNA/靶基因”交互作用分子网络的初步构建及功能研究

论文摘要

miRNAs调控是一种与RNA干扰既相似又有本质区别的基因表达调控方式。miRNAs能抑制许多癌基因和抑瘤基因从而在肿瘤发生过程中起重要的作用。从miRNAs的转录、加工、成熟到作用于靶mRNAs的过程中,转录因子、miRNAs和靶基因之间组成错综复杂的调控网络。miRNAs在鼻咽癌中也存在表达的失活或异常。c-Myc是一个非常重要的转录因子,能调控许多基因的表达,近年来已有众多研究发现c-Myc癌基因的异常激活、过度表达与鼻咽癌的发生发展及预后存在着密切关系。Western-blot检测也证实5-8F等鼻咽癌细胞株中均存在内源性c-Myc的高表达。前期研究表明:封闭内源性c-Myc的高表达,可抑制5-8F细胞生长,抑制5-8F细胞G1-S细胞周期进程,减弱5-8F细胞的侵袭迁移能力,下调Rb/E2F信号通路重要分子的蛋白表达水平。研究发现c-Myc也能调控一些miRNA分子,它是否也能通过调控miRNA分子而参与鼻咽癌的发生发展研究并不多,为深入探讨鼻咽癌细胞中封闭内源性c-Myc表达后的miRNA分子网络调控机制,本课题用本室前期构建的封闭内源性c-Myc表达的稳定转染鼻咽癌细胞系5-8F/si-c-Myc和对照细胞系5-8F/si-Control,进行miRNA芯片分析,筛选受c-Myc转录调控的miRNA分子,从miRNA水平探讨鼻咽癌发生发展的分子机制。进行了如下实验:1.miRNA芯片分析与实验验证显示hsa-mir-141和hsa-mir-200c在封闭内源性c-Myc的表达后显著下调,证实hsa-mir-141和hsa-mir-200c鼻咽癌组织中的表达高于鼻咽正常上皮组织miRNA芯片分析,筛选到14个表达上调3倍以上的差异表达miRNA分子和7个下调3倍以上的差异表达miRNA分子,其中hsa-mir-141和hsa-mir-200c在封闭内源性c-Myc的表达后下调了10倍以上,并且hsa-mir-141和hsa-mir-200c的Northern-blot、qRT-PCR验证结果和芯片结果相一致。qRT-PCR分析激光捕获显微切割纯化后的鼻咽癌组织和正常鼻咽上皮组织,其中hsa-mir-141和hsa-mir-200c在鼻咽癌组织中的表达水平比鼻咽正常上皮组织要高,有统计学意义(P<0.025,P<0.04)。2.hsa-mir-141和hsa-miR-200c正性调控Rb/E2F、AKT信号转导通路参与鼻咽癌细胞周期进程和侵袭转移将hsa-mir-141和hsa-mir-200c的mimics及inhibitors转染鼻咽癌细胞系5-8F、5-8F/Si-c-Myc及对照细胞系5-8F/Si-control后,进行MTT、流式细胞术检测、细胞划痕、Transwell基质胶侵袭实验,分析hsa-mir-141和hsa-mir-200c对鼻咽癌细胞活力、细胞周期及细胞运动侵袭能力的影响。用Western-blot分析hsa-mir-141和hsa-mir-200c对相关信号转导通路的影响。结果如下:抑制hsa-mir-141和hsa-mir-200c的表达可抑制5-8F细胞G1-S细胞周期进程,进而抑制5-8F细胞生长,并减弱5-8F细胞的侵袭迁移能力。过表达has-mir-141和has-mir-200c后,可促进5-8F/Si-c-Myc细胞G1-S细胞周期进程,促进其细胞生长,并增强5-8F/Si-c-Myc细胞的侵袭迁移能力。在5-8F/Si-c-Myc细胞中过表达has-mir-141不同程度上调Rb/E2F信号通路重要分子cyclinD1、pRb、E2F3、DP2的蛋白表达水平;过表达has-mir-200c后上调cyclinD1、pRb的蛋白表达水平;过表达has-mir-141和has-mir-200c均上调AKT信号转导通路关键分子pAKT的蛋白表达水平。而在5-8F/Si-control细胞中抑制has-mir-141的功能后下调cyclinD1、pRb、E2F3、DP2的蛋白表达水平;抑制has-mir-200c的功能后下调cyclinD1、pRb的蛋白表达水平;抑制has-mir-141和has-mir-200c的功能后同时下调AKT信号转导通路关键分子pAKT的蛋白表达水平。以上结果表明hsa-mir-141和hsa-miR-200c正性调控Rb/E2F、AKT信号转导通路参与鼻咽癌细胞周期进程和侵袭转移。3.生物信息学预测分析并实验验证结果显示:BRD3是hsa-miR-141调控的靶基因,PTEN是has-mir-141和hsa-miR-200c共同调控的靶基因生物信息学分析,通过miRBase::Sequences软件分析差异表达miRNA分子的基本信息,通过在线miRNA靶基因预测软件targetscan、pictar对下游靶基因进行预测,用DAVID 2008 FunctionalAnnotation Bioinformatics Microassay Analysis Tools系统和TumorSuppressor Gene Database在线基因功能分析软件对所预测的潜在靶基因进行归类及基因功能分析。使用荧光素酶报告系统、Western-blot实验对预测的潜在靶基因进行实验验证。miRBase::Sequences软件分析,发现hsa-miR-141和has-mir-200c属12号染色体p13.31上同一miRNA基因蔟,它们之间的物理距离小于10kb。提示hsa-miR-141和has-mir-200c在功能上可能存在密切联系。生物信息学在线软件分析发现多个与鼻咽癌发病密切相关的信号通路分子是hsa-miR-141和hsa-miR-200c的潜在靶基因,如PTEN,BRD3,UBAP1,CDC42,GRB2,MAP2K4,MAP3k3等。这些靶分子涉及到重要的信号转导通路Rb/E2F、AKT、Ras/MEK/ERK、和MAPK等。荧光素酶报告系统和Western-blot实验验证结果显示:生物信息学预测的潜在靶基因中BRD3是hsa-miR-141调控的靶基因,PTEN是has-mir-141和hsa-miR-200c共同调控的靶基因。4.BRD3负性调控Rb/E2F信号通路构建了BRD3的重组表达载体pCMV-Myc/BRD3。在5-8F细胞中过表达BRD3,然后进行Wetern-Blotting检测Rb/E2F信号转导通路关键分子,发现BRD3下调cyclinD1、pRb、E2F3的蛋白表达水平,结果表明BRD3负性调控Rb/E2F信号通路。5.全基因组芯片分析封闭内源性c-Myc表达后对5-8F细胞基因表达谱的影响全基因组芯片和生物信息学分析结果显示,上调明显(FOLDchange>2)的有400个基因(EGR1、DMBT1等),下调明显(FOLDchange>2)的有535个基因(CDK2、HMGA2等)。这些差异基因涉及到MAPK,TGF-beta Receptor,JAK-STAT及细胞周期,细胞增殖,细胞黏附,细胞紧密连接,侵袭转移等多条相关通路。采用差异RT-PCR对EGR1、DMBT1、CDK2、HMGA2进行了实验验证。验证结果与全基因组芯片分析结果相符。结论:1.证实了hsa-miR-141和hsa-mir-200c是受c-Myc正性调控的miRNA分子,且在鼻咽癌组织比正常组织表达要高,可能起到瘤基因的作用。2.证实了BRD3是hsa-miR-141调控的靶基因,而PTEN是hsa-mir-141和hsa-miR-200c共同调控的靶基因。3.证实了c-Myc通过hsa-mir-141和hsa-miR-200c的靶分子(BRD3和PTEN)正性调控Rb/E2F、AKT信号转导通路参与鼻咽癌细胞周期进程和侵袭转移。4.全基因组芯片和生物信息学分析证实封闭内源性c-Myc表达后上调EGR1、DMBT1下调CDK2、HMGA2等基因,提示c-Myc通过调控这些基因参与鼻咽癌细胞生长增殖。5.综合上述研究,初步构建了“c-Myc/miRNA/靶基因”交互作用的分子网络,并绘制了网络图。

论文目录

  • 中文摘要
  • 英文摘要
  • 目录
  • 缩写词简表
  • 第一章 前言
  • 技术流程
  • 第二章 材料与方法
  • 2.1 材料
  • 2.1.1 细胞系
  • 2.1.2 菌株和质粒载体
  • 2.1.3 试剂
  • 2.1.4 自配试剂
  • 2.1.5 主要仪器
  • 2.2 方法
  • 2.2.1 Western—blotting分析
  • 2.2.2 miRNA芯片检测
  • 2.2.3 miRNA Northern blot验证
  • 2.2.4 miRNA RealTime RT-PCR分析
  • 2.2.5 鼻咽癌标本及鼻咽慢性炎症对照标本采集
  • 2.2.6 组织细胞通过显微切割进行纯化
  • 2.2.7 miRNA产品转染目的细胞
  • 2.2.8 MTT
  • 2.2.9 流式细胞分析细胞周期改变与细胞凋亡率
  • 2.2.10 细胞划痕试验
  • 2.2.11 Transwell试验
  • 2.2.12 差异miRNA生物信息学分析
  • 2.2.13 pMIR-REPORT miRNAExpression Reporter表达载体的构建
  • 2.2.14 荧光素酶报告质粒转染细胞及荧光素酶报告基因活性分析
  • 2.2.15 pCMV-Myc/BRD3重组质粒的构建
  • 2.2.16 全基因组芯片分析
  • 2.2.17 差异RT-PCR验证全基因组芯片结果
  • 第三章 结果
  • 第一部分 miRNA芯片分析及差异表达miRNA分子的实验验证
  • 3.1.1 Western—blotting检测5-8F/Si-c-Myc和5-8F/Si-control细胞内源性c-Myc的表达
  • 3.1.2 miRNA芯片检测
  • 3.1.3 芯片结果的验证
  • 3.1.4 鼻咽癌组织和正常鼻咽上皮组织的hsa-mir-141和hsa-mir-200c表达情况检测
  • 第二部分 hsa-mir-141和hsa-mir-200c在鼻咽癌细胞系5-8F、5-8F/Si-c-Myc及对照细胞系5-8F/Si-control中的生物学功能研究
  • 3.2.1 hsa-mir-141和hsa-mir-200c在鼻咽癌细胞系5-8F中的细胞生物学功能研究
  • 3.2.2 封闭内源性c-Myc表达导致hsa-mir-141和hsa-mir-200c显著下调,可能是引起鼻咽癌5-8F/Si-c-Myc细胞生物学功能改变的原因之一
  • 第三部分 hsa-mir-141和hsa-mir-200c的生物信息学分析及其下游靶基因的预测与实验验证
  • 3.3.1 生物信息学分析hsa-mir-141和hsa-mir-200c的基本信息
  • 3.3.2 hsa-mir-141和hsa-mir-200c下游靶基因预测
  • 3.3.3 对预测的潜在靶基因进行实验验证
  • 第四部分 BRD3对Rb/E2F信号转导通路的影响
  • 3.4.1 pCMV-Myc/BRD3重组质粒的构建
  • 3.4.2 BRD3对Rb/E2F信号转导通路的影响
  • 第五部分 封闭内源性c-Myc表达的鼻咽癌细胞5-8F/Si-c-Myc和对照细胞5-8F/Si-control的全基因组芯片检测及差异表达基因的验证
  • 3.5.1 全基因组芯片分析
  • 3.5.2 RT-PCR对部分差异表达基因的验证
  • 第四章 讨论
  • 第一部分 封闭内源性c-Myc表达的鼻咽癌细胞5-8F/Si-c-Myc和对照细胞5-8F/Si-control中差异表达miRNA芯片筛选及实验验证
  • 4.1.1 miRNA芯片筛选
  • 4.1.2 对miRNA芯片筛选结果的实验验证
  • 第二部分 hsa-mir-141和hsa-mir-200c在鼻咽癌细胞系5-8F、5-8F/Si-c-Myc及对照细胞系5-8F/Si-control中的生物学功能研究
  • 4.2.1 hsa-mir-141和hsa-mir-200c在鼻咽癌细胞系5-8F中可能起到瘤基因的作用
  • 4.2.2 封闭内源性c-Myc表达导致hsa-mir-141和hsa-mir-200c显著下调,可能是引起鼻咽癌5-8F/Si-c-Myc细胞生物学功能改变的原因之一
  • 第三部分 hsa-mir-141和hsa-mir-200c的生物信息学分析及其下游靶基因的预测与实验验证
  • 4.3.1 hsa-mir-141和hsa-mir-200c的基本信息分析
  • 4.3.2 hsa-mir-141和hsa-mir-200c下游靶基因预测及归类分析
  • 4.3.3 对预测的潜在靶基因进行实验验证
  • 第四部分 BRD3负调控Rb/E2F信号转导通路,而PTEN负调控AKT信号转导通路
  • 4.4.1 BRD3负调控Rb/E2F信号转导通路
  • 4.4.2 PTEN负调控AKT信号转导通路
  • 第五部分 全基因组芯片分析封闭内源性c-Myc表达对鼻咽癌5-8F细胞基因表达谱的影响及部分差异表达基因的验证
  • 4.5.1 封闭内源性c-Myc表达后鼻咽癌5-8F细胞中部分表达上调的抑瘤基因如:EGR1、DMBT1等
  • 4.5.2 封闭内源性c-Myc表达后鼻咽癌5-8F细胞中部分表达下调的瘤基因如:CDK2、HMGA2等
  • 第六部分 "c-Myc/hsa-mir-141和hsa-mir-200c/靶基因"交互作用分子网络的初步构建
  • 结论
  • 参考文献
  • 综述
  • 致谢
  • 个人简历
  • 相关论文文献

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