钝顶螺旋藻表达载体的构建及转化研究

论文摘要

本文研究螺旋藻对刀豆氨酸（CS）和不同抗生素的耐受性和敏感性;提取螺旋藻抗CS突变株A9c的基因组DNA转化野生藻株A9,获得同源转化螺旋藻的参数组合;构建含有螺旋藻A9启动子的外源质粒载体p215t-spp,并将其转入螺旋藻A9,实现绿色荧光蛋白GFP在螺旋藻细胞内的稳定表达。本研究初步建立了一套螺旋藻遗传转化操作系统,可为螺旋藻转基因操作提供重要技术参考。Chl、Str对螺旋藻均有很强的抑制作用,在液体培养条件下,1.0μg·ml-1的Chl、3μg·ml-1的Str对螺旋藻有完全的致死作用;固体培养条件下,1.2μg·ml-1的Chl、4μg·ml-1的Str可完全抑制螺旋藻在固体平板上的生长。Amp对螺旋藻有较强抑制作用,液体培养时Amp对螺旋藻的MIC为100μg·ml-1;固体培养时Amp对螺旋藻的MIC约为200μg·ml-1。螺旋藻对Km很不敏感,在600μg·ml-1Km的液体培养基中,螺旋藻的生长完全不受抑制。Chl、Str和Amp均适合作为螺旋藻的抗性筛选标记,筛选浓度分别为:1.2μg·ml-1、4μg·ml-1、200μg·ml-1。将螺旋藻抗CS突变株A9c的基因组DNA作为材料转化野生藻株A9,以30μg·ml-1的CS作为筛选压力,获得了转化藻株,得到了一些同源转化的参数:在低于最适生长温度的条件下（24℃）培养螺旋藻;转化前用2mmol·L-1的EDTA预处理24h;利用超声波对螺旋藻进行处理,功率为300w,处理时间为70s;采用自然转化方法,冰浴处理,避光条件下液体培养后涂平板,筛选转化子。本实验以构建的携带grp基因的质粒p215t-spp和出发质粒p215t作为载体,分别采用冰浴法和PEG融合法转化螺旋藻A9藻株,成功实现了gfp基因在螺旋藻株中的表达。比较了用不同质粒在相同条件下转化A9藻株的转化率,数据显示p215t-spp可以比p215t极显著提高转化率（α=0.01）,初步证明采用螺旋藻的启动子构建质粒可以提高转化效果;比较了相同质粒用不同方法转化A9藻株的转化率,数据显示采用适当浓度的PEG可以有效的提高转化率。经过反复实验证明,采用1%的PEG浓度作用30min可以获得较高转化率（10.5‰）。对转化藻株进行荧光检测,藻丝段在390nm蓝光激发下发出绿色荧光,证实gfp基因在转化藻株中得到有效表达。连续观察转化藻株荧光发光情况发现,转化藻株转接3次后均可观察到绿色荧光,证明了gfp基因成功实现了在螺旋藻细胞内的稳定表达。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 文献综述
• 1 引言
• 1.1 研究价值和意义
• 1.2 国内外研究现状
• 1.3 本研究拟解决的问题
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验藻株和菌株
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 仪器与试剂
• 2.1.4 试剂的配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 螺旋藻的培养及抗性测定
• 2.2.2 载体构建
• 2.2.3 同源转化方法的建立
• 2.2.4 表达载体p215t-spp在螺旋藻中的转化
• 3 结果与分析
• 3.1 螺旋藻A9藻株对常见抗生素抗性测定
• 3.1.1 螺旋藻A9藻株对Chl的敏感性
• 3.1.2 螺旋藻A9藻株对Km的敏感性
• 3.1.3 螺旋藻A9藻株对Amp的敏感性
• 3.1.4 螺旋藻A9藻株对Str的敏感性
• 3.2 螺旋藻同源转化方法的建立
• 3.3 螺旋藻A9基因组DNA和质粒p215t的提取
• 3.4 质粒p215t的酶切和螺旋藻A9启动子的PCR扩增
• 3.5 质粒p215t-spp的构建
• 3.6 重组子在大肠杆菌中的表达
• 3.7 表达载体p215t-spp转化螺旋藻细胞研究
• 3.8 转化藻株和出发藻株形态和生长速度的比较
• 3.9 p215t-spp质粒在螺旋藻细胞中的表达
• 4 讨论
• 4.1 螺旋藻的几种抗生素筛选标记
• 4.2 螺旋藻胞内限制性内切酶活性的影响
• 4.3 质粒载体的选择构建研究
• 4.4 螺旋藻遗传转化方法研究
• 4.5 gfp基因在螺旋藻中的表达
• 5 结论
• 5.1 螺旋藻对抗生素敏感性的测定
• 5.2 同源DNA转化螺旋藻参数组合的研究
• 5.3 外源gfp基因在螺旋藻细胞内的表达
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介
• 在读期间发表的学术论文