大熊猫基因资源库构建及粪便高质量DNA提取方法的建立

论文摘要

1.本文以大熊猫的成纤维细胞和肝组织细胞为材料,以pBeloBAC11为载体,构建了大熊猫基因组的细菌人工染色体DNA文库。该文库包含了93700个克隆,分别保存于977块96孔细胞培养板中。经过对100个随机抽样的克隆分析表明,插入片段的平均大小为160kb,相当于大熊猫基因组的5倍,即5个库容量。酶切10个克隆证明,经过100代繁殖后,其插入片段仍稳定不变。 2.采用RNeasy Mini Kit提取大熊猫肝脏和脑组织的总RNA,经oligotex试剂盒纯化得到mRNA。利用SMART(switching mechanism at 5’end of RNA transcript)技术,构建了肝脏和脑组织的全长cDNA文库。在构建完成的文库中,肝脏文库含有约5.0×10~6个重组子,而脑组织文库含有约3.5×10~6个重组子。在2个文库中,插入的cDNA长度为400bp—4kb,重组率高达90%以上。鉴定结果表明,大熊猫肝脏和脑组织cDNA文库质量良好,为进一步筛选和克隆大熊猫肝脏与脑组织特异性表达基因,提供了材料平台。 3.通过本研究,建立了从大熊猫粪便样品中提取高质量DNA的技术体系:(1)通过足量粪便提取足量的DNA:(2)加入BSA能有效控制PCR抑制物的干扰作用;(3)通过分级离心的方法富集大熊猫消化道上皮细胞。研究同时表明,使用该方法还能够从福尔马林固定的粪便中提取大片段的DNA。这一技术体系的建立,促进了大熊猫保护遗传学的研究,也为其它野生动物的保护遗传学研究提供了良好的技术借鉴。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述——基因组文库构建及其研究进展
• 1. 基因组文库的产生和发展
• 1.1 克隆载体的发展
• 1.2 细菌人工染色体文库的构建
• 2. 保护遗传学的产生和发展
• 3. 基因组文库在保护遗传学方面的应用及展望
• 第二章 大熊猫基因组DNA文库构建
• 1. 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 试剂
• 1.3 主要的仪器设备及耗材
• 1.4 方法
• 2 结果
• 2.1 BAC载体的制备
• 2.2 文库构建的效率
• 2.3 BAC克隆的酶切结果
• 2.4 克隆稳定性的检测结果
• 3 讨论
• 3.1 克隆载体的制备
• 3.2 高分子量DNA的制备
• 3.3 脉冲场电泳条带的形成
• 3.4 电转化参数
• 第三章 大熊猫肝及脑组织cDNA文库构建
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 试剂
• 1.3 总RNA抽提与mRNA分离
• 1.4 DNA合成和文库构建
• 1.5 DNA文库的质量鉴定
• 2 结果
• 2.1 大熊猫肝cDNA文库
• 2.2 大熊猫脑cDNA文库
• 3 讨论
• 第四章 大熊猫粪便高质量DNA提取方法的建立
• 1 材料
• 1.1 样品
• 1.2 试剂
• 1.3 主要的仪器设备
• 2 方法
• 2.1 DNA提取
• 2.2 银镜反应试验
• 2.3 脉冲场电泳
• 2.4 PCR扩增
• 2.5 DNA指纹技术
• 2.6 探针标记
• 2.7 分子杂交
• 2.8 膜或胶的再杂交
• 2.9 统计分析
• 3 结果与讨论
• 3.1 粪便DNA的提取
• 3.2 粪便DNA的长期保存
• 参考文献
• 攻读博士论文期间投稿及发表的论文目录
• 致谢
• 独创性声明
• 学位论文版权使用授权书