论文摘要
在我国,慢性HBV感染是引起慢加急性肝衰竭（acute-on-chronic liver failure, ACLF）的主要病因。ACLF病情凶险,进展迅速,预后较差,虽然近年来在ACLF的治疗等方面取得了很大的进展,但病死率仍高达50%～60%。这与ACLF发病机制尚不明确直接相关,故明确其发病机制对提高ACLF的治疗水平具有重要意义。我们前期对感染HBV的单卵孪生子（monozygotic twins, MZ twins）临床观察发现,同样感染HBV,MZ孪生子间表现出完全不同的临床表型。MZ孪生子相当于天然的“克隆人”,共享遗传背景,排除了DNA序列差异对基因表达的影响,其HBV感染途径一致,但表现出明显不同的表型,考虑可能主要是由于表观遗传学修饰机制所致。近年研究发现DNA甲基化、小分子RNA （microRNAs, miRNAs）和基因印迹等表观遗传调控机制广泛参与了病毒复制、炎症和免疫调节等过程。故我们推测表观遗传调控机制在HBV感染后ACLF的发病中可能起重要作用。了解DNA甲基化、miRNAs和基因印迹等表观遗传调控机制在ACLF患者与对照样本之间差异表达有助于筛选出与ACLF相关的表观遗传现象,为进一步阐明表观遗传调控在ACLF发病中的具体机制奠定基础。所以我们以HBV感染后表型分别为ACLF和无症状携带者（asymptomatic carrier, AsC）的一对MZ孪生子标本为基础,采用以下方法观察了ACLF和AsC患者间DNA甲基化、基因印迹和miRNAs表达的差异。以期了解表观遗传调控与ACLF的关系。方法：1.采用Agilent Human CpG Islands arrays芯片对MZ孪生子进行了全基因组差异甲基化芯片扫描,获得HBV感染后表型不同MZ孪生子间差异甲基化基因谱。通过Roche Nimblegen表达谱芯片进行全基因组表达扫描,获得HBV感染后表型不同MZ孪生子间差异表达基因谱。联合分析甲基化基因的表达和基因已知功能筛选出可能与ACLF发病相关的甲基化基因。2.通过表达谱芯片结果筛选出MZ孪生子间差异表达印迹基因,并采用荧光定量RT-PCR在52例HBV感染后ACLF患者和48例AsC患者间验证差异表达情况。然后采用PCR—限制性片断长度多态性（restriction fragment length polymorphism, RFLP）分析筛选IGF2基因杂合标本；并用基于RT-PCR的RFLP分析检测杂合标本的印迹状态。采用χ2检验分析印迹基因IGF2在ACLF患者和AsC患者印迹状态差异。3.采用Exiqon miRNA Array芯片完成孪生子间差异1niRNA表达谱扫描,获得差异表达miRNA谱。并采用荧光定量RT-PCR在104例HBV感染后ACLF患者和96例AsC患者间验证表达差异。Targetscan、iRanda和PicTar数据库多重比对等方法预测差异表达miRNA靶基因。主要研究结果：1.在ACLF MZ孪生子有47条基因特异性甲基化且表达下调或无表达；有88条基因特异性非甲基化且表达上调,其中28条基因仅在ACLF MZ孪生子有表达。这些差异表达基因与炎症信号通路,炎症介质表达,微循环障碍等密切相关。生物信息学分析发现以下7条基因的异常甲基化可能与肝炎发病相关：ZEB1、USP47、BTF3L4、 ADCYAP1、 PLCH2、F10和PAK6。2.发现ACLF MZ孪生子中上调印迹基因13条：DDC、TFPI2、KLF14、ABCA1、 IGF2、IGF2AS、KCNQ1DN、CDKN1C、SLC22A18AS、MEG3、DLK1、 ATP10A及TCEB3C;下调印迹基因8条：SGCE、PEG10、DLX5、SNRPN、MKRN3、MAGEL2. NNAT及L3MBTL2。可能与肝脏炎症相关的IGF2、DKN1C和TFPI2均在ACLF患者表达增高（P<0.001）。IGF2在ACLF患者发生基因印迹缺失（loss of imprinting, LOI）较AsC患者明显增加（55.56%vs.21.05%,P=0.045）。3.在MZ孪生子间发现差异表达miRNA53条；45条在ACLF MZ表达上调,8条表达下调。hsa-let-7a、hsa-mir-16在ACLF患者表达明显增高,分别增高8.58和8.63倍（P<0.001）。靶基因预测结果发现BCL2、CARD8、EDA、IL1RAPL1、LTB及FZD10可能为hsa-mir-16参与ACLF发病的靶基因；CERCAM、IGF2BP1、OPRM1及MAP4K3可能为hsa-let-7a参与ACLF发病的靶基因。结论：1.HBV感染后ACLF患者与AsC患者间存在基因差异甲基化、印迹基因和miRNAs表达差异等表观遗传漂移现象。证实表观遗传调控可能参与了ACLF的发生。2.IGF2在ACLF患者表达较AsC患者明显增加,其原因与IGF2在ACLF患者发生基因印迹缺失的比例增加有关。3.let-7a、mir-16在ACLF患者表达明显增高。mir-16可能通过调节BCL2、ARD8等的表达；let-7a可能通过调节IGF2BP1、MAP4K3等的表达参与肝脏炎症的发生。