芽孢杆菌amyF基因的克隆、表达、产物纯化及其生物学活性研究

论文摘要

芽孢杆菌Bacillus sp. WS06是一株在仔猪结肠内容物中分离出的能利用豆类淀粉的兼性厌氧菌。本研究设计了一对引物,应用PCR方法从芽孢杆菌Bacillus sp.WS06构建的全基因组DNA文库中扩增了α-淀粉酶基因amyF,并将其克隆到原核表达载体pET-21a中,成功构建了重组质粒pETAF,在大肠杆菌BL21（DE3）中获得了较高表达。推测amyF编码的蛋白有526个氨基酸、分子量为58.6 kD;amyF基因经核苷酸序列测定,与已报道的Bacillus megaterium的α-淀粉酶基因序列有着93%的同源性。经氨基酸序列比较分析发现,AmyF含有淀粉酶家族中四个高度保守的酶催化活性区。经多步纯化后,达到电泳纯的重组酶的比活比粗酶液提高了22.2倍,获得凝胶电泳均一的蛋白样品;经SDS-PAGE电泳测定,AmyF酶分子量为57kD。该酶最适反应温度为55℃～60℃,酶的最适反应pH为7.0,在pH范围为2.2～12.8,温度不超过55℃时,酶活较稳定;金属离子Cu2+、Fe3+、Fe2+、Zn2+、柠檬酸根离子和金属熬合剂EDTA对酶活有显著抑制作用,Mg2+、Mn2+、H2PO4有微弱的抑制作用,K+、Ca2+和表面活性剂SDS有微弱的激活作用;除了像普通α-淀粉酶一样能迅速内切降解可溶性淀粉生成麦芽寡糖外,该酶还对直链淀粉含量高的抗性淀粉和豆类淀粉都有理想的水解作用,表明该酶可能在猪结肠中抗性淀粉的消化和代谢过程中起重要作用。 为了进一步研究抗性淀粉在肠道中微生物发酵与淀粉酶的关系,设计了抗性淀粉的动物饲喂试验,收集结肠末端内容物,洗涤获得混合菌体,简单模拟肠道内环境,体外厌氧恒温培养,采样测定分析相关指标。结果发现,随着抗性淀粉摄入水平的增加,动物肠道中淀粉酶和降解生成的还原糖含量以及利用淀粉的相关菌群也有相应增加趋势。另外还测定了盲肠内容物的pH值和氨含量,并对十二指肠、盲肠和结肠做了石蜡切片,从肠道微环境和肠道结构变化说明抗性淀粉对动物肠道健康的影响。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1.前言
• 1.1 抗性淀粉的分类
• 1.2 抗性淀粉的化学特性和颗粒结构
• 1.3 抗性淀粉的生理学特性及生理功能
• 1.3.1 抗性淀粉的生理学特性
• 1.3.2 抗性淀粉的生理功能
• 1.4 抗性淀粉的应用
• 1.5 其它的不消化性碳水化合物
• 1.6 淀粉酶等酶制剂及其在饲料中的应用
• 2.材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株、质粒
• 2.1.2 试验动物
• 2.1.3 主要分子生物学试剂和化学试剂
• 2.1.4 分离纯化材料
• 2.1.5 试验大鼠饲料配制
• 2.1.6 常用液体及培养基的配制
• 2.1.7 主要仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 芽孢杆菌amyF基因的克隆和在大肠杆菌中的表达
• 2.2.2 芽孢杆菌amyF基因表达产物分离纯化及其酶活性鉴定
• 2.2.3 淀粉酶AmyF的酶学性质
• 2.2.4 抗性淀粉对大鼠肠道中利用淀粉菌群的影响
• 3.结果
• 3.1 芽孢杆菌amyF基因的克隆和在大肠杆菌中的表达
• 3.1.1 amyF基因表达载体的构建
• 3.1.2 amyF基因的诱导表达
• 3.2 芽孢杆菌amyF基因表达产物分离纯化及其酶活性鉴定
• 3.2.1 淀粉酶酶活性鉴定
• 3.2.2 淀粉酶AmyF的纯化
• 3.3 淀粉酶AmyF的酶学性质
• 3.3.1 牛血清白蛋白（BSA）的标准曲线
• 3.3.2 温度对AmyF的活性的影响
• 3.3.3 pH对酶活性的影响
• 3.3.4 化学试剂对酶活的影响
• 3.3.5 酶的水解性质
• 3.3.6 酶对不同淀粉底物的Km值
• 3.4 抗性淀粉对大鼠肠道中利用淀粉菌群的影响
• 2摄入水平对大鼠肠粘膜屏障结构的影响'>3.4.1 不同RS₂摄入水平对大鼠肠粘膜屏障结构的影响
• 2摄入水平对大鼠盲肠内容物pH的影响'>3.4.2 不同RS₂摄入水平对大鼠盲肠内容物pH的影响
• 2摄入水平对大鼠盲肠内容物氨含量的影响'>3.4.3 不同RS₂摄入水平对大鼠盲肠内容物氨含量的影响
• 3.4.4 体外发酵培养试验淀粉酶、还原糖含量和利用淀粉的菌总数比较
• 4 讨论
• 4.1 芽孢杆菌amyF基因的克隆和在大肠杆菌中的表达
• 4.2 芽孢杆菌amyF基因表达产物分离纯化及其酶活性鉴定
• 4.3 淀粉酶AmyF的酶学性质
• 4.4 抗性淀粉对大鼠肠道中利用淀粉菌群的影响
• 5 结论
• 6 参考文献
• 致谢
• 附录1 amyF基因序列
• 附录2 质粒构建图
• 攻读学位期间发表的学术论文目录