乳酸片球菌素的表达纯化与高密度发酵研究

论文摘要

天然防腐剂的研究与开发随着人们对食品安全性的认识和要求的提高,近年来成为食品工业的一个热点。细菌素（bacteriocin）是一些细菌产生的一类蛋白抗菌物质,可以用作防腐剂,因其安全有效性而得到人们的重视。但细菌素产生菌许多因为产量低、基因表达不稳定而未得到应用。从乳酸菌分离的细菌素由于它们的抗食源性病菌、食物腐败细菌活性已经被一些研究者研究。乳酸片球菌素（Pediocin）由于它的强抗利斯特氏菌活性而被较多关注。在本课题的前期研究中,我们从牛初乳中筛选到了一株产Pediocin的乳酸片球菌Pediococcus acidilacticii LH311。本课题研究分离纯化来自P.acidilacticiiLH31的细菌素（pediocin PA-1）,鉴定其理化性质,并克隆Pediocin基因,进行异源表达,研究其表达特性,进行高密度发酵,实施碳氮营养源平衡流加策略,实现高效表达。利用细胞吸附法初步分离乳酸片球菌素,再经半制备型反相液相色谱得到纯品。对纯化的乳酸片球菌素进行Tris-Tricine系统电泳,测定其分子量为5 000 Da左右。采用酶蛋白（来源于纤维化纤维微细菌（Cellulosimicrobium cellulans）的纤维素酶和木聚糖酶）特性鉴定的思路、经验、方法,来鉴定短肽乳酸片球菌素（pediocin PA-1）的特性,得出最适抑菌温度为25℃,最适抑菌pH为6；乳酸片球菌素在沸水浴处理一段时间后,仍有一定活性,但是随着时间的增长,其活性逐渐降低；在较宽范围pH处理后仍有较稳定的活性,在pH接近酸性时稳定性更高；较高浓度的乳酸片球菌素的稳定性较高,这可能是由于高浓度时分子间集聚反应起到了对极端温度和pH的缓冲作用。由系列梯度乳酸片球菌素对粪肠球菌实验得出其最低抑菌浓度（MIC）为50μg/mL,制定了不同剂量乳酸片球菌素的时间杀菌曲线。为在大肠杆菌中高效表达乳酸片球菌素pediocin PA-1 （PED）,按照NCBI上公布的PED基因序列设计合成引物,以乳酸片球菌（Pediococcus acidilacticii LH31）基因组DNA为模板,用PCR扩增PED结构基因特异片段,构建编码组氨酸标记硫氧还原蛋白融合蛋白PED-N的重组表达质粒pET32c-PED,并转化大肠杆菌BL21（DE3）和BL21（DE3）pLysS。在IPTG诱导后融合型乳酸片球菌素（fusion-typed pediocin PA-1, PED-N）以包涵体形式表达,经镍亲合层析纯化的PED-N用肠激酶裂解,再经超滤纯化,可得78%的收率。PED-N没有抗粪肠球菌（Enterococcus faecalis）细菌素活性,被分开的PED恢复了它的抑菌活性。研究实现了细菌素PED在大肠杆菌中的高效融合表达,并得到有生物学活性的PED,为进一步研究其应用奠定了一定的基础,同时也为研究细菌素表达提供了一种方法。分析比较不同IPTG诱导条件（诱导温度、诱导时间、诱导剂浓度）对于PED-N表达的影响,以确定最佳IPTG诱导条件。对于BL21（DE3）,PED-N的表达水平在诱导后3小时达到最大；对于BL21（DE3）pLysS,PED-N的表达水平在诱导后5小时达到最大。对于BL21（DE3）,PED-N的表达水平在诱导剂浓度为0.2 mmol/L最大,对于BL21（DE3）pLysS,PED-N的表达水平在诱导剂浓度为2.0 mmol/L时最大。BL21（DE3）pLysS的菌浓、PED-N产率均比同培养条件下BL21（DE3）要高。在37℃条件下诱导,两菌株均获得高效表达,目标蛋白以包涵体形式为主；BL21（DE3）pLysS表达水平高于BL21（DE3）；而BL21（DE3）表达的可溶性蛋白比例略高于BL21（DE3） pLysS.在30℃条件下诱导,两菌株同样获得高效表达,但表达水平均较于37℃条件下低；目标蛋白仍然均以包涵体形式为主,但是可溶性蛋白比例均比37℃条件下高；BL21（DE3）pLysS表达水平低于BL21（DE3）,而BL21（DE3）pLysS表达的可溶性蛋白比例略高于BL21（DE3）。Triton X-100对包涵体PED-N溶解性有显著影响,裂解液和洗涤液中均含有1%Triton X-100作用于包涵体后,可溶性PED-N蛋白的含量高于裂解液不含Triton X-100、洗涤液中含有1% Triton X-100的可溶性PED-N蛋白含量。尿素的浓度可对融合蛋白PED-N包涵体溶解起着重要作用,随着尿素浓度的增加,可溶性蛋白的含量呈上升之势。3 mol/L尿素即可使近一半的PED-N包涵体溶解,5 mol/L尿素时可使大部分的PED-N包涵体变为可溶性的。在尿素中加入STT可以大大增加对PED-N包涵体溶解作用。优化表达融合型乳酸片球菌素（PED-N）工程菌的高密度发酵条件。筛选半合成培养基作为发酵培养基,其作为高密度培养基的成分甘油最适浓度为10 mL/L,氮源蛋白胨最适浓度为5 g/L。选择在37℃下,恒pH 6.5-7.0培养,在工程菌对数生长中期进行诱导。采用1g/L乳糖作为诱导剂,诱导表达的时间为5 h。用自控发酵罐进行溶氧反馈一限制性补料高密度发酵,控制补料速率以稳定比生长率在0.2 h-1上下,溶氧值反馈值设定于30%-40%。最终菌体密度A600值达到了116,PED-N的表达量为1.09 g/L。DO-stat流加发酵时间相对于恒速流加较短、相对于加速流加较长,甘油利用充分、残余量少,表达目的蛋白PED-N效率最高。本文还对碳氮比、碳氮平衡补料流加策略对重组E.coliBL21（DE3）pLysS生长与表达PED-N的影响进行了研究。摇瓶实验结果当碳氮比为1.0时菌体浓度达到最大值,可溶性PED-N有最大比例,碳氮比过高或过低均不利于菌体生长；碳氮比较高或较低时,可溶性PED-N比例较低、包涵体PED-N所占比例较高。在重组E.coliBL21（DE3）pLysS培养的不同时间阶段补料流加不同碳氮比的营养源,实现碳氮实时流加平衡,有效地避免了乙酸的积累,获得了高密度的菌体（最大菌体密度湿重可达81.8 g/L）,PED-N表达产率、可溶性PED-N比例也较高（PED-N含量可达0.463 g/L,可溶性PED-N蛋白含量可达0.157 g/L）。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 天然食品防腐剂与细菌素
• 1.1.1 天然食品防腐剂的发展需求
• 1.1.2 细菌素的概念与来自乳酸菌的细菌素
• 1.1.3 细菌素的抗菌机制
• 1.1.4 细菌素的基因工程
• 1.2 乳酸片球菌素（Pediocin）的研究概况
• 1.2.1 乳酸片球菌素的理化性质与抑菌活性
• 1.2.2 乳酸片球菌素的生化和基因研究
• 1.2.3 乳酸片球菌素转基因研究
• 1.2.4 国内对乳酸片球菌素的研究
• 1.3 现代生物技术、重组蛋白质与大肠杆菌表达系统
• 1.3.1 关于现代生物技术的一般表述
• 1.3.2 基因工程与重组蛋白质
• 1.3.3 大肠杆菌表达系统
• 1.3.3.1 外源蛋白在大肠杆菌中表达的相关影响因素
• 1.3.3.2 表达系统E.coli BL21（DE3）/pET
• 1.4 重组大肠杆菌高密度发酵技术
• 1.4.1 重组Escherichia coli高密度培养概述
• 1.4.2 重组大肠杆菌构建的影响因素
• 1.4.2.1 宿主菌的选择
• 1.4.2.2 质粒载体
• 1.4.3 高密度培养过程中培养基成分及作用与优化设计
• 1.4.3.1 培养基成分的作用
• 1.4.3.2 工程菌高密度培养基优化设计
• 1.4.4 培养条件对重组大肠杆菌生长及外源基因表达的影响
• 1.4.4.1 溶氧
• 1.4.4.2 温度
• 1.4.4.3 pH值
• 1.4.5 高密度培养方式
• 1.4.5.1 非反馈控制补料
• 1.4.5.2 反馈控制补料
• 1.4.6 重组大肠杆菌诱导方式的影响
• 1.4.7 抑制性代谢产物乙酸对菌体生长及外源基因表达的影响
• 1.4.7.1 代谢副产物的抑制作用及生成机制
• 1.4.7.2 控制乙酸生成的策略
• 1.4.8 比生长速率的控制
• 1.5 本课题研究的主要内容及意义
• 第二章 乳酸片球菌素的分离纯化与性质鉴定
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 仪器与试剂
• 2.2.1.1 主要仪器
• 2.2.1.2 主要试剂
• 2.2.2 菌株
• 2.2.3 培养基
• 2.2.4 菌种的活化、培养
• 2.2.5 细胞吸附法提取乳酸片球菌素
• 2.2.6 半制备型反相液相色谱RP-HPLC纯化
• 2.2.7 乳酸片球菌素活性的测定
• 2.2.8 蛋白浓度的测定
• 2.2.9 Tricine-SDS-PAGE电泳检测乳酸片球菌素
• 2.2.10 温度和pH对乳酸片球菌素活性的影响
• 2.2.10.1 温度对乳酸片球菌素活性的影响
• 2.2.10.2 pH对乳酸片球菌素活性的影响
• 2.2.11 乳酸片球菌素稳定性的鉴定
• 2.2.11.1 pH对乳酸片球菌素稳定性的影响
• 2.2.11.2 温度对乳酸片球菌素稳定性的影响
• 2.2.11.3 乳酸片球菌素浓度对其稳定性的影响
• 2.2.12 乳酸片球菌素对粪肠球菌的最低抑菌浓度（MIC）的测定
• 2.2.13 乳酸片球菌素对粪肠球菌（E.faecalis）的时间杀菌曲线的测定
• 2.2.14 来源于纤维化纤维微细菌（Cellulosimicrobium cellulans）的纤维素酶和木聚糖酶的生产与鉴定
• 2.3 实验结果与讨论
• 2.3.1 细胞吸附法、半制备型RP-HPLC分离纯化乳酸片球菌素
• 2.3.2 Tricine-SDS-PAGE电泳检测细胞吸附法分离乳酸片球菌素的结果
• 2.3.3 蛋白浓度与活性测定结果
• 2.3.4 乳酸片球菌素的活性
• 2.3.4.1 温度对乳酸片球菌素活性的影响
• 2.3.4.2 pH对乳酸片球菌素活性的影响
• 2.3.5 乳酸片球菌素的稳定性
• 2.3.5.1 pH对乳酸片球菌素稳定性的影响
• 2.3.5.2 温度对乳酸片球菌素稳定性的影响
• 2.3.5.3 乳酸片球菌素浓度对其稳定性的影响
• 2.3.6 乳酸片球菌素对粪肠球菌的最低抑菌浓度（MIC）
• 2.3.7 乳酸片球菌素对粪肠球菌的时间杀菌曲线
• 2.3.8 来源于纤维化纤维微细菌（Cellulosimicrobium cellulans）的纤维素酶和木聚糖酶的生产与鉴定
• 2.4 小结
• 第三章 融合型乳酸片球菌素在大肠杆菌中的表达与纯化
• 3.1 引言
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 仪器、试剂与材料
• 3.2.1.1 主要仪器
• 3.2.1.2 试剂与材料
• 3.2.2 质粒与菌株
• 3.2.3 实验方法
• 3.2.3.1 质粒的抽提
• 3.2.3.2 PCR产物的纯化
• 3.2.3.3 切胶纯化回收DNA片段
• 3.2.3.4 DNA电泳
• 3.2.3.5 Tris-SDS-PAGE电泳
• 3.2.4 pediocin基因的克隆、表达与产物纯化
• 3.2.4.1 pediocin基因的克隆
• 3.2.4.2 PED表达质粒的构建
• 3.2.4.3 质粒转化
• 3.2.4.4 重组菌的培养、诱导表达
• 3.2.4.5 表达产物的分离纯化
• 3.2.5 蛋白浓度与PED-N表达水平的测定
• 3.2.5.1 蛋白浓度的测定
• 3.2.5.2 PED-N表达水平的测定
• 3.2.6 细菌素活性检定
• 3.2.7 重组质粒pET32c-PED的稳定性
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 pediocin基因的克隆
• 3.3.2 表达质粒pET32c-PED的构建
• 3.3.3 融合型乳酸片球菌素的表达
• 3.3.4 重组蛋白的纯化及活性检定
• 3.3.5 重组质粒pET32c-PED的稳定性
• 3.4 本章小结
• 第四章 重组乳酸片球菌素的表达特性
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料与仪器
• 4.2.1 仪器、试剂与菌株
• 4.2.1.1 主要仪器
• 4.2.1.2 试剂
• 4.2.1.3 菌株
• 4.2.2 分析方法
• 4.2.2.1 菌浓的测定
• 4.2.2.2 取样方法
• 4.2.2.3 Tris-SDS-PAGE电泳
• 4.2.3 BL21（DE3）与BL21（DE3）pLysS诱导后生长与表达产率的差异
• 4.2.4 温度对BL21（DE3）与BL21（DE3）pLysS两菌株表达特性的影响
• 4.2.5 IPTG浓度对BL21（DE3）与BL21（DE3）pLysS两菌株表达水平的影响
• 4.2.6 菌体裂解液和包涵体洗涤液组成成分对包涵体溶解性的影响
• 4.2.7 尿素浓度对包涵体溶解的影响
• 4.2.8 二硫苏糖醇（DTT）对包涵体溶解的影响
• 4.3 结果和讨论
• 4.3.1 BL21（DE3）、BL21（DE3）pLysS诱导后细胞生长与PED-N表达产率的差异
• 4.3.2 IPTG诱导时间对BL21（DE3）与BL21（DE3）pLysS两菌株表达的影响
• 4.3.3 温度对BL21（DE3）与BL21（DE3）pLysS两菌株表达的影响
• 4.3.4 IPTG浓度对BL21（DE3）与BL21（DE3）pLysS两菌株表达的影响
• 4.3.5 菌体裂解液和包涵体洗涤液组成成分对包涵体溶解性的影响
• 4.3.6 尿素浓度对融合蛋白PED-N包涵体溶解性的影响
• 4.3.7 DTT对融合蛋白PED-N包涵体溶解性的影响
• 4.4 本章小结
• 第五章 高密度培养重组大肠杆菌表达融合型乳酸片球菌素
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 仪器、试剂、菌株与培养基
• 5.2.1.1 主要仪器
• 5.2.1.2 试剂
• 5.2.1.3 菌株
• 5.2.1.4 培养基
• 5.2.2 分析方法
• 5.2.2.1 菌浓的测定
• 5.2.2.2 PED-产率的测定
• 5.2.2.3 乙酸含量的测定
• 5.2.2.4 甘油浓度的测定
• 5.2.2.5 高密度培养过程中工程菌的稳定性分析
• 5.2.3 E.coli BL21/pET32c-PED高表达菌株的活化与筛选
• 5.2.4 摇瓶发酵条件优化
• 5.2.4.1 培养基的筛选
• 5.2.4.2 培养基碳源浓度优化
• 5.2.4.3 培养基氮源浓度优化
• 5.2.4.4 pH值优化
• 5.2.5 诱导条件优化
• 5.2.5.1 诱导剂乳糖浓度
• 5.2.5.2 诱导温度
• 5.2.5.3 诱导后表达时间
• 5.2.5.4 诱导剂加入方式
• 5.2.6 高密度发酵条件的优化
• 5.2.6.1 培养方法
• 5.2.6.2 溶氧浓度的优化
• 5.2.6.3 比生长速率μ的优化
• 5.2.6.4 溶氧反馈-分批补料高密度发酵
• 5.2.6.5 三种流加方式比较
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 发酵培养基的筛选
• 5.3.2 培养基pH值对工程菌生长和PED-N表达的影响
• 5.3.3 甘油浓度对工程菌生长和PED-N表达的影响
• 5.3.4 蛋白胨浓度对工程菌生长和PED-N表达的影响
• 5.3.5 最佳乳糖浓度的确定
• 5.3.6 诱导温度对PED-N表达的影响
• 5.3.7 乳糖最佳诱导时间的确定
• 5.3.8 诱导剂加入方式
• 5.3.9 高密度发酵最佳溶氧浓度
• 5.3.10 比生长速率μ的优化
• 5.3.11 E.coli BL21/pET32c-PED工程菌的高密度发酵
• 5.3.12 流加方式对高密度发酵的影响
• 5.3.13 工程菌稳定性检测
• 5.4 小结
• 第六章 多阶段碳氮比流加策略对重组大肠杆菌生长和融合型乳酸片球菌素表达的影响
• 6.1 引言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 仪器、试剂与菌株
• 6.2.1.1 主要仪器
• 6.2.1.2 试剂
• 6.2.1.3 菌株
• 6.2.2 分析方法
• 6.2.2.1 菌浓的测定
• 6.2.2.2 取样方法
• 6.2.2.3 蛋白浓度的测定
• 6.2.2.4 Tris-SDS-PAGE电泳
• 6.2.3 摇瓶实验碳氮比对重组E.coli生长的影响
• 6.2.4 碳氮比对可溶性PED-N和PED-N包涵体表达的影响
• 6.2.5 培养方法与补料流加策略
• 6.2.5.1 培养基
• 6.2.5.2 补料流加策略
• 6.2.6 碳氮平衡流加对重组E.coli生长的影响
• 6.2.7 碳氮平衡流加对PED-N表达的影响
• 6.2.8 碳氮平衡流加对残糖与乙酸积累的影响
• 6.2.8.1 葡萄糖残糖浓度的测定
• 6.2.8.2 乙酸积累量的测定
• 6.3 结果与讨论
• 6.3.1 摇瓶实验碳氮比对重组E.coli生长的影响
• 6.3.2 碳氮比对PED-N表达的影响（摇瓶）
• 6.3.3 碳氮平衡流加过程中的多阶段碳氮比
• 6.3.4 碳氮平衡流加对重组E.coli生长的影响
• 6.3.5 碳氮平衡流加对PED-N表达的影响
• 6.3.6 碳氮平衡流加对残糖与乙酸积累的影响
• 6.4 小结
• 第七章 结论与展望
• 7.1 结论
• 7.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读博士期间发表的论文