论文摘要
RNA干扰（RNAi）是双链RNA介导的、序列特异的转录后基因沉默现象,RNAi能高效特异地阻断基因的表达。siRNA是RNAi过程中的21 nt-23 nt的小干扰RNA,是RNAi产生效应的中介分子。RNA干扰技术是利用RNAi的原理来人为抑制特异基因表达的一种基因阻断技术。由于其特异性、高效性和易于实现的特点,因此立即吸引了基因功能研究者的注意,并迅速成功应用于多物种的基因功能研究中,从最初的线虫、果蝇等低等生物其应用范围逐渐延伸到哺乳动物,并从单一、特定基因的研究推广到全基因组水平的功能研究。由于要利用RNA干扰进行大规模、高通量的功能基因筛查,由此出现了RNA干扰文库（RNAi library）的概念。现有的哺乳动物细胞RNAi文库有三种：已知基因RNAi文库、来源于cDNA文库的亚随机RNAi文库和完全随机的RNAi文库。本课题选用了我们课题组自己构建的完全随机RNAi文库。该文库的siRNA编码序列位于相向双启动子之间,其中18bp的核苷酸编码序列完全是化学随机合成的,理论上包括了可以涵盖任意基因的siRNA序列。又由于这一随机RNAi文库是用化学合成的方法获得的siRNA编码序列,该文库可以不受生物或组织来源以及细胞内基因表达水平的限制。因此可以在一个较宽的生物范围内适用,而且在低水平表达基因的功能研究中将具有更明显的优势,是后基因组时代基因功能研究的有力手段。我的主要工作包含两部分内容,一是筛选诱导P19细胞分化的siRNA。我们用随机siRNA文库筛选与P19细胞分化相关的siRNA。将随机siRNA文库质粒稳定转染P19细胞,通过条件选择型筛选方法实现阳性表型细胞的分离,通过克隆的方法获得阳性表型细胞群中所整合的siRNA序列。在重复筛选一次,富集阳性表型的克隆。然后进行单克隆验证,得到了四个可以诱导P19细胞分化的siRNA：C-2-10、C-2-29、C-2-49、C-2-87。通过进一步验证与鉴定,富集次数最高的两个克隆C-2-10、C-2-29具有诱导P19细胞分化的能力,且分化后的细胞为神经前体细胞；C-2-49、C-2-87这两个克隆也具有诱导P19细胞分化的能力,分化后的细胞大部分为神经前体细胞,少数为较成熟神经样细胞,且分化得到的神经前体细胞具有进一步分化为较成熟神经样细胞与胶质样细胞的能力。我们又在E14/T小鼠胚胎干细胞中验证C-2-49、C-2-87这两个克隆诱导细胞分化的能力,实验证明这两个克隆可以诱导E14/T小鼠胚胎干细胞分化为神经前体细胞。我们通过对随机siRNA文库筛选得到了诱导P19细胞分化的siRNA。本研究旨在通过对随机siRNA文库的筛选来批量获取一系列诱导P19细胞分化的siRNA,为细胞分化方面的研究增加新的资料。我们实验室通过对随机siRNA文库的筛选得到了一些与MC3T3-E1细胞增殖相关的基因。我的第二部分工作是对Txndc5、Tmed2、Nov这三个基因在促进MC3T3-E1细胞增殖方面的功能进行了验证,通过MTS、检测细胞周期等方法确实这三个基因具有促进MC3T3-E1细胞增殖加快的能力,且可以增加MC3T3-E1细胞S期比例。我们对Txndc5、Nov这两个基因在促进细胞增殖加快方面的机制进行了初步研究,通过对相关周期蛋白的检测,发现Txndc5、Nov这两个基因通过调控cyclin A转录水平的增加来调节cyclin A的增加,以增高细胞S期比例,达到促进细胞增殖加快的目的。MC3T3-E1细胞在βEstradiol作用下增殖加快,此时Txndc5表达增加,说明该基因表达的增加可能参与了生理功能。我们希望通过研究能够发现一些基因的新功能并对细胞增殖机制的进一步研究提供新的线索。综上所述,我们建立了基于细胞功能表型的siRNA文库的筛选方法；用随机siRNA文库成功地进行了大规模筛选,获得了多个诱导P19细胞分化的siRNA序列和与MC3T3-E1细胞增殖相关基因,为细胞分化与增殖机制的进一步研究提供了新的线索；也为后基因组时代提供了高效、快速的功能基因研究平台。
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