论文摘要
背景：驱动蛋白样DNA结合蛋白Kid属于驱动蛋白家族（kinesin family, KIF）。Kid分子结构中N端的微管驱动区和ATP酶活性区及C端的DNA结合区和核定位区决定了该蛋白既具有Kinesin的微管驱动功能,又具有DNA结合蛋白（DNA binding protein, DBP）的转录因子功能。Kid作为微管驱动蛋白在有丝分裂的整个生物学过程中都起着关键作用,参与纺锤体的形成、染色体的运动以及调节细胞进入有丝分裂的末期；另外,Kid作为转录调节因子可能调节癌基因ErbB-2的表达。目前,国外关于Kid的研究仅限于对其分子结构和基于分子结构的功能描述,关于Kid在肿瘤发生发展中的作用机制尚无研究报道。本研究室前期研究发现Kid的编码基因kinesin-like4（KNSL4）在乳腺癌的淋巴结转移癌中的表达较其配对原发癌下调,KNSL4mRNA在乳腺原发癌中的下调与乳腺癌患者差的预后相关,提示Kid在乳腺癌的发生发展中发挥重要作用。目的：通过筛选Kid下游的转录调节基因,并对筛选得到的候选靶基因进行生物学验证,进一步探讨Kid蛋白作为转录调节因子在乳腺癌发生发展中的作用机制。方法：联合染色质免疫沉淀技术（chromatin immunoprecipitation, ChIP）和启动子基因芯片（microarray）技术（ChIP-on chip）,筛选Kid结合的候选靶基因。采用DNA选择性连接（DNA selection and ligation, DSL）的方法标记Kid抗体富集的DNA,筛选其与启动子芯片杂交的荧光强度与无抗体对照比较差异达2倍以上的基因作为候选的Kid调控靶基因;采用ChIP联合实时定量PCR（ChIP-qPCR）方法验证Kid与候选靶基因ATF7IP、CDC25、TM4SF3、PIP的启动子区（-100bp～+400bp）的结合。采用RNA干扰（RNA interference, RNAi）方法分别靶向KNSL4的第二和第三外显子沉默,Kid在乳腺癌细胞MCF-7中的表达。采用实时定量RT-PCR和western blot方法检测Kid的mRNA和蛋白的表达量,筛选Kid低表达的稳定亚克隆,分别命名为MCF-7/exon2-siRNA和MCF-7/exon3-siRNA;采用实时定量RT-PCR （real time RT-PCR）方法比较ATF7IP、CDC25C、TM4SF3、PIP mRNA在MCF-7/exon3-siRNA与对照组MCF-7/vector细胞中mRNA表达量的差异。结果：1.DSL标记方法用于启动子芯片杂交的ChIP-DNA模板量为100ng,与连接介导PCR （ligation mediate PCR, LM-PCR）方法比较,DSL方法显著提高了检测转录因子靶基因的灵敏度,并减少了抗体用量和实验成本。2.共筛选出287个Kid调控的候选靶基因,其中26个与细胞周期调控相关,27个与信号传导相关,40个与转录调节相关,17个与细胞黏附相关,16个与细胞运动相关。ATF7IP基因在Kid抗体免疫沉淀DNA中的富集比无抗体免疫沉淀的阴性对照高4.8倍,CDC25C为8.3倍,PIP为11倍,TM4SF3为27.9倍。3.实时定量PCR检测ChIP的实验样本与阴性对照样本中ATF7IP、PIP CDC25C及TM4SF3启动子区扩增产物的差异,结果在实验样本中ATF7IP扩增产物比阴性对照高4.9倍,CDC25C为10倍,PIP为3倍,TM4SF3为11.8倍。4.与MCF-7/vector比较,MCF-7/exon3-siRNA中的KNSL4mRNA下调80%,Kid蛋白下调68%。MCF-7/exon2-siRNA中CNSL4mRNA下调76%,Kid蛋白下调52%。5.与MCF-7/vecto·比较,MCF-7/exon3-siRNA细胞中ATF7IP mRNA表达上调3.5倍,CDC25C mRNA表达上调10倍,PIP和TM4SF3在MCF-7/vector和MCF-7/exon3-siRNA细胞中均无表达。结论：1.本研究采用DSL标记法可以减少用于芯片杂交的ChIP-DNA模板量,检测灵敏度高于]LM-PCR标记法。2.本研究建立了Kid低表达的MCF-7细胞亚克隆。3.Kid蛋白对ATF7IP和CDC25C基因的转录具有负向调节作用,Kid可能通过调节其靶基因的转录进而影响乳腺癌的生物学行为。
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标签：乳腺癌论文; 转录调节论文; 驱动蛋白样结合蛋白论文; 染色质免疫沉淀论文; 启动子芯片论文; 转录激活因子协调蛋白论文; 细胞分裂周期素论文;