纳豆激酶的表达与复性研究

论文摘要

纳豆激酶（Nattokinase,NK）是从日本传统食品纳豆中分离得到,由来源于枯草芽孢杆菌的纳豆激酶基因表达产生的具有高效、安全的溶栓活性的蛋白激酶。在纳豆激酶的表达研究中一直存在这样的争议问题:在不含前导肽辅助的情况下,纳豆激酶包涵体是否能通过常规复性方法正确折叠复性。而且争论双方对纳豆激酶复性的具体方法很少提及。分析前人的表达方法后我们提出这样的问题:是否纳豆激酶N端融合的各式各样的多余序列影响了纳豆激酶成熟肽的正确折叠复性?基于上述问题,本研究使用NdeI和XhoI限制酶构建重组表达载体pET-42b-NK,将其转化到BL21中,IPTG诱导表达出包涵体形式的纳豆激酶。基于载体pET-42b的特点,纳豆激酶N端不含任何冗余序列以减少对蛋白折叠的影响,同时C端融合His-Tag以利于纯化复性。使用透析和稀释两种复性方法加上各种添加剂的组合,对经过尿素变性和亲和层析纯化后的包涵体进行复性,以研究在无前导肽辅助以及N端冗余序列的影响,常规复性方法和复性添加剂是否能使纳豆激酶正确折叠复性,为长久以来的争议问题提供某方面的证据。本研究结果如下:1.构建了纳豆激酶N端不含冗余序列而C端融合His-Tag的原核表达载体pET-42b-NK。2.获得了高效表达纳豆激酶包涵体的菌株BL21以及高效诱导方法,目的蛋白表达量约占菌体总蛋白的30%。3.建立了包涵体分离以及亲和层析纯化等一整套方法,可一步纯化得到高纯度的目的蛋白。4.纳豆激酶的复性研究表明,在无前导肽辅助以及N端冗余序列的影响,透析和稀释两种复性方法加上各种复性添加剂的组合不能使纳豆激酶正确折叠复性,论证支持了在不含前导肽辅助的情况下,纳豆激酶包涵体不能通过常规复性方法正确折叠复性的观点。为了获得高产量、高活性的纳豆激酶,需要采用其它方法,如,表达出前导肽作为复性促进剂,或使用易错PCR方法对纳豆激酶进行序列突变,筛选出不需要前导肽就能止确折叠的纳豆激酶突变体。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 1 前言
• 1.1 血栓形成与体内纤溶系统
• 1.2 溶栓药物
• 1.3 纳豆激酶
• 1.3.1 纳豆激酶的溶栓活性
• 1.3.2 纳豆激酶的理化性质
• 1.3.3 纳豆激酶基因及其表送研究
• 1.4 高效表达形成包涵体
• 1.4.1 包涵体形成原因
• 1.4.2 包涵体表达的优点
• 1.4.3 包涵体表达的瓶颈
• 1.4.4 包涵体蛋白的复性
• 1.4.4.1 包涵体的分离与溶解
• 1.4.4.2 蛋白折叠理论
• 1.4.4.3 复性方法
• 1.4.4.4 影响复性的因素
• 1.5 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 质粒与菌株
• 2.1.2 仪器设备
• 2.1.3 酶与试剂
• 2.1.4 PCR引物
• 2.2 方法
• 2.2.1 TA克隆纳豆激酶基因
• 2.2.1.1 提取质粒p-NK
• 2.2.1.2 PCR扩增纳豆激酶基因
• 2.2.1.3 连接纳豆激酶基因与pUCm-T载体
• 2.2.1.4 制备E.coli.DH5α感受态细胞
• 2.2.1.5 连接液转化E.coli.DH5α感受态细胞
• 2.2.2 构建原核表达载体pET-42b-NK
• 2.2.2.1 提取质粒pUCm-T-NK与pET-42b
• 2.2.2.2 双酶切基因与载体
• 2.2.2.3 连接基因与载体
• 2.2.2.4 制备E.coli.BL21感受态细胞
• 2.2.2.5 连接液转化E.coli.BL21感受态细胞
• 2.2.3 IPTG诱导表达与SDS-PAGE分析
• 2.2.3.1 IPTG小量诱导表达
• 2.2.3.2 SDS-PAGE分析
• 2.2.4 纯化包涵体蛋白
• 2.2.4.1 大量诱导表达
• 2.2.4.2 溶解包涵体
• 2+螯合柱纯化'>2.2.4.3 Ni²⁺螯合柱纯化
• 2.2.5 变性蛋白的复性
• 2.2.5.1 透析复性
• 2.2.5.2 稀释复性
• 2.2.5.3 活性测定
• 3 结果与分析
• 3.1 TA克隆纳豆激酶基因
• 3.1.1 PCR扩增NK基因结果
• 3.1.2 TA克隆的PCR、双酶切检测
• 3.1.3 TA克隆的测序验证与序列分析
• 3.2 原核表达载体pET-42b-NK的构建
• 3.2.1 NK基因与载体pET-42b的双酶切
• 3.2.2 pET-42b-NK的PCR与双酶切检测
• 3.2.3 pET-42b-NK的测序验证与序列分析
• 3.3 IPTG小量诱导表达蛋白的SDS-PAGE
• 3.4 包涵体蛋白纯化结果
• 3.4.1 IPTG大量诱导表达
• 3.4.2 包涵体的分离与溶解
• 2+螯合柱亲和层析纯化'>3.4.3 Ni²⁺螯合柱亲和层析纯化
• 3.5 包涵体蛋白复性结果
• 3.5.1 透析复性结果
• 3.5.2 稀释复性结果
• 4 讨论
• 4.1 表达载体构建方法比较
• 4.2 本研究结果说明的问题
• 4.3 问题的解决方法与展望
• 5 小结
• 参考文献
• 在学期间研究成果
• 致谢
• 附录