重组犬2型腺病毒及其免疫研究 ——携带狂犬病病毒糖蛋白膜外区基因的活载体疫苗

论文摘要

狂犬病（Rabies）近年来在我国呈快速上升势头,据卫生部公布的数据表明,2001年全国狂犬病死亡人数891例;2002年全国狂犬病死亡人数1122例;2003年全国狂犬病死亡人数2037例;2004年全国狂犬病死亡人数2651例;狂犬病正严重地危害人民的生命健康。人患狂犬病大部分是由带毒犬咬伤引起的。目前我国用于犬狂犬病预防的疫苗主要是浓缩的灭活苗和弱毒活疫苗,前者由于制备成本昂贵,主要在发达城市推广使用;后者虽然相对便宜,但存在毒力返祖的潜在危险;因此研制安全、有效、廉价的犬用狂犬病疫苗具有重要的实际意义。 狂犬病病毒是狂犬病的病原体,属弹状病毒科、狂犬病病毒属,是单股负链RNA病毒,其基因组分别编码N、NS、M、G、L五种蛋白,其中糖蛋白（N）是狂犬病病毒中唯一能刺激机体产生中和抗体的成分,且抗原表位都集中在膜外区部分。活载体疫苗具有成本低、效果好和使用安全、方便等诸多优点。犬2型腺病毒（Canine Adenovirus type2,CAV-2）弱毒株是批准用于犬传染性肝炎和犬传染性喉气管炎免疫预防的疫苗株。CAV-2有四个早期转录区,其中E3区是病毒复制的非必需区,缺失或插入外源基因不会影响病毒的复制。因此,CAV-2具有发展成为活疫苗载体的潜力。 本研究旨在通过基因工程手段构建一种新型的活载体狂犬病疫苗,这种疫苗以犬的2型腺病毒为载体,在其基因组中加入狂犬病病毒的保护性抗原基因—狂犬病病毒糖蛋白的膜外区部分,当重组病毒感染犬时,它所携带的狂犬病病毒糖蛋白基因随之进入犬的细胞中并表达狂犬病病毒糖蛋白,刺激机体产生针对狂犬病病毒的免疫应答,从而使被免疫动物产生对狂犬病病毒的保护力。 本研究通过RT-PCR技术从狂犬病病毒SRV9株细胞毒扩增得到狂犬病病毒糖蛋白膜外区序列,以其为目的基因克隆入pEGFP-C1,取代其中绿色荧光蛋白基因,获得了以CMV为启动子、SV40polyA为终止信号的表达载体pERVG2;以AseⅠ&MluⅠ双酶切游离表达盒,正、反向克隆入经SspⅠ&DraⅢ双酶切、部分缺失犬2型腺病毒E3区的中间质粒pVAX-E3中;再以改造后的E3区与犬2型腺病毒全基因组质粒pCAV-2中的E3区进行置换,获得重组犬2型腺病毒基因组。以AscⅠ&ClaⅠ双酶切,从质粒中释放出重组腺病毒全基因组,转染MDCK细胞,分别获得了克隆有糖蛋白膜外区正、反向表达盒的重组犬2型腺病毒。两株重组腺病毒免疫幼犬,初步的动物免疫结果显示,无论表达盒是正向还是反向插入基因组,糖蛋白膜外区在犬体内均得到了有效表达,产生了针对狂犬病病毒的免疫应答。但正向插入的重组病毒的免疫效果好于反向,具体原因尚待阐明。本研究建立了一种新的、高效的重组犬2型腺病毒的方法,为重组腺病毒活载体疫苗的构建开辟了一条新途径;在国内首次研制出狂犬病的活载体疫苗,技术手段达到世界领先水平。

论文目录

• 摘要
• 英文摘要
• 引言
• 第一章 理论分析
• 1 狂犬病病毒的基因结构及其功能
• 1.1 狂犬病病毒形态、组成及基因结构
• 1.2 病毒基因组的编码产物与功能
• 1.2.1 狂犬病毒糖蛋白和核蛋白
• 1.2.2 糖蛋白（GP）研究
• 1.2.3 核蛋白（NP）研究
• 2 犬腺病毒载体构建的研究进展
• 2.1 腺病毒载体的构建
• 2.1.1 构建原理
• 2.1.2 构建方法
• 2.2 重组犬腺病毒载体的构建
• 2.2.1 犬腺病毒及其基因组简介
• 2.2.2 CAV-2特点
• 2.2.3 重组CAV载体的构建
• 3 腺病毒载体应用概况及特点
• 3.1 腺病毒载体应用的概况
• 3.2 腺病毒载体的应用特点
• 3.2.1 腺病毒载体转移基因的有效性
• 3.2.2 腺病毒载体应用的安全性
• 3.2.3 本研究的立题依据
• 第二章 试验研究
• 试验一 狂犬病病毒糖蛋白膜外区基因的克隆及测序
• 1 材料方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株、病毒、细胞和质粒
• 1.2 方法
• 1.2.1 感受态菌的制备、质粒的转化、质粒制备与纯化
• 1.2.2 DNA琼脂糖凝胶电泳
• 1.2.3 DNA操作
• 1.2.4 重组质粒的鉴定
• 9株糖蛋白膜外区的克隆'>1.2.5 狂犬病病毒SRV₉株糖蛋白膜外区的克隆
• 2 结果
• 2.1 T-PCR结果
• 2.2 T载体克隆和测序
• 3 讨论
• 试验二 构建表达狂犬病病毒糖蛋白膜外区的重组犬2型膝病毒
• 1 材料方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株、病毒、细胞和质粒
• 1.2 方法
• 1.2.1 细菌的培养和质粒的酶切、连接及转化
• 1.2.2 表达盒和重组腺病毒基因组的构建
• 1.2.3 转染MDCK细胞
• 1.2.4 重组病毒基因组的提取
• 2 结果
• 2.1 表达盒的构建
• 2.2 重组犬2型腺病毒E3区
• 2.3 重组犬2型腺病毒基因组的构建
• 2.4 重组基因组的转染及新病毒的包装
• 3 讨论
• 试验三 重组病毒的免疫研究
• 1 材料方法
• 1.1 材料
• 1.1.2 病毒、细胞与犬
• 1.1.3 材料与试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 ELISA法检测狂犬病病毒糖蛋白表达
• 1.2.2 细胞的PAGE电泳
• 1.2.3 Western blot分析
• 1.2.4 免疫原性研究
• 2 结果
• 2.1 RV糖蛋白膜外区的真核表达检测
• 2.2 免疫原性分析
• 2.3 遗传稳定性分析
• 3 讨论
• 第三章 结论
• 参考文献
• 致谢