甜瓜属人工异源双二倍体Cucumis hytivus早期世代遗传与表观遗传变化

论文摘要

多倍化是高等植物进化过程的重要阶段,是植物进化的主要动力之一。研究表明,异源多倍体在形成的早期会出现广泛的基因组遗传和表观遗传变化,这些变化直接关系到物种的形成和稳定。然而,现存的天然多倍体大多形成于成千上万年前,很难确定进化中种种不稳定现象发生的具体过程和机制。虽然分子标记及比较基因组学的发展为认识杂交及多倍化进程提供了重要依据,但由于分子进化机制的复杂性,这方面的相关机理知之甚少。人工合成的异源多倍体则为这方面的研究提供了良好的模式系统。通过这种模式系统,可以精确比较亲本二倍体种与人工异源多倍体早期世代间的基因组变化特点,从而为丰富多倍体物种进化理论提供重要的实证。本研究基于实验室已合成的甜瓜属远缘杂种F1及人工合成的异源双二倍体及其不同自交世代,比较研究了杂种F1及异源双二倍体的减数分裂染色体行为特征、基因组位点变化和甲基化模式变化特点,探索了远缘杂交与多倍化引发远缘杂种F1和异源双二倍体基因组发生遗传和表观遗传变化的机制。具体如下:1.远缘杂种F1及异源双二倍体减数分裂染色体行为与花粉育性研究研究了野生种C.hystrix（2n=2X=24）与栽培黄瓜C.sativus L.（2n=2X=14）远缘杂种F1（2n=2X=19）、双二倍体及双二倍体（2n=4X=38）自交1～4代的减数分裂染色体行为特征与花粉育性。结果表明:减数分裂中期Ⅰ,杂种F1花粉母细胞（pollen mother cell,PMC）染色体主要以单价体存在,染色体构型为:16.75Ⅰ+0.5Ⅱ+0.25Ⅲ+0.13Ⅳ;双二倍体染色体构型以二价体为主,伴随着自交,平均每个PMC所含二价体比例逐渐增加,非二价体配对比例减少。四分体时期,F1不能形成正常的四分孢子,主要以多分孢子形态存在;双二倍体以四分孢子为主,并随着自交世代的增高,其比例增加。花粉育性观察发现,随着自交世代的增高,双二倍体花粉育性呈增加趋势。以上结果暗示双二倍体在遗传上逐渐趋于稳定。双二倍体PMCs在后期Ⅰ、Ⅱ普遍含有落后染色体、染色体桥及染色体不均等分离等异常现象,这可能是导致其花粉育性低于期望值的原因。2.甜瓜属远缘杂种F1及人工异源双二倍体早期基因组序列变化研究利用12对Eco RI/Mse I选择性引物,对甜瓜属人工异源双二倍体C.hytivus及其二倍体父母本进行AFLP分析,结果发现多倍体基因组在形成早期发生了广泛的序列变化。基因组序列变化始于F1代,变化最剧烈的时期发生在S0到S1代。但在S1到S2代基因组序列变化比率基本接近,暗示了伴随着异源双二倍体的自交过程,早期基因组表现出稳定的趋势,说明基因组序列变化是一个快速的事件。基因组序列变化主要表现为部分亲本片段丢失、新片段产生以及后代对亲本某些位点的跳跃式继承。对变化的序列进行深入研究发现,变化的序列主要是重复序列。实验还观察到少部分双亲差异性条带呈现出偏父性遗传的特点。不同分类群的异源多倍体在二倍化过程中,正反交序列丢失往往表现出不同特征,暗示了在不同物种中核质互作在多倍体进化过程的作用不同。为了研究细胞质背景对基因组序列丢失的影响,利用23对Eco RI-NN/Mse I-NNN选择性引物对Cucumishystrix与栽培黄瓜C.sativus的正反交F1、异源双二倍体及亲本DNA进行AFLP分析。结果表明:杂种F1与异源双二倍体基因组发生了广泛的序列丢失。正交后代与反交后代在丢失亲本基因组序列的频率上差异不显著,并且在序列丢失时间（均始于F1代）及丢失类型上也表现出相同的特点,表明核质互作并不是影响序列丢失的主要因素。实验还发现,不论正交还是反交,后代丢失普通黄瓜基因组序列数大于丢失野生种基因组序列数,表明甜瓜属多倍化早期阶段易于丢失染色体数比较少的亲本基因组序列。3.甜瓜属远缘杂交及多倍化诱发基因组DNA胞嘧啶甲基化变化特征研究为了研究DNA甲基化在甜瓜属人工异源多倍体形成过程中的作用,利用methylation-sensitive amplification polymorphism（MSAP）技术,对甜瓜属远缘杂种F1、人工异源双二倍体及亲本基因组DNA进行研究。结果发现,远缘杂种F1及人工异源双二倍体基因组发生了胞嘧啶甲基化模式变化,表明远缘杂交及多倍化均可诱发基因组胞嘧啶甲基化发生变化。甲基化变化根据变化模式的不同可以分为五种类型,主要是脱甲基化类型（甲基化水平降低）和过甲基化类型（甲基化水平升高）,并且发生过甲基化变化的位点数是发生脱甲基化变化的2-4倍,说明甲基化变化主要表现为亲本基因组的部分位点在后代中发生过甲基化。研究还发现,与父本基因组相比,母本基因组在远缘杂交后代中易发生过甲基化变化,暗示了DNA甲基化在识别和保护自身DNA中起重要作用。对异源双二倍体不同自交世代甲基化进行研究,在S1和S2代之间发生甲基化模式变化的位点数显著多于S2和S3代,表明伴随着自交世代的升高,双二倍体基因组胞嘧啶甲基化变化剧烈程度逐渐降低,基因组逐渐趋于稳定,DNA甲基化可能在遗传二倍化过程中起重要作用。为了研究甜瓜属异源双二倍体在形成及稳定过程中甲基化变化位点的特征特性,我们对远缘杂交及多倍化诱发的基因组胞嘧啶甲基化变化位点进行分析。结果发现,在克隆测序的15条序列中,有7条序列与已知功能基因或调控基因具有较高的相似性。根据测序结果设计特异引物,进行PCR验证分析,发现MSAP多态性由DNA甲基化修饰引起。并且RT-PCR分析发现胞嘧啶甲基化可能参与了甜瓜属人工异源双二倍体基因表达的调控,表明其在异源多倍体二倍体化过程中起到重要作用。Southernblot结果发现,甲基化变化序列不仅有单拷贝序列,而且也有部分是多拷贝序列。为了研究组织培养对胞嘧啶甲基化的影响,利用MSAP技术研究了随机选取的普通黄瓜‘长春密刺’实生苗与组织培养再生苗之间胞嘧啶甲基化差异,结果发现在胞嘧啶甲基化水平上,实生苗与组织培养再生苗之间没有差异。对甲基化模式进行进一步研究分析发现,与实生苗相比,组培再生苗部分位点发生了甲基化模式的变化,但变化位点仅占总位点的0.6%。暗示了组织培养不能引起胞嘧啶甲基化发生很大程度的变化。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 引言
• 上篇 文献综述
• 第一章 植物异源多倍体遗传及表观遗传变化研究进展
• 摘要
• Abstract
• 1.植物异源多倍体
• 2.植物多倍化过程中的遗传变化
• 2.1 多倍化诱发的亲本序列丢失
• 2.2 多倍化诱发的基因组重组
• 2.3 多倍化诱发的转座子变化
• 3.植物多倍化诱发的表观遗传变化
• 3.1 DNA甲基化
• 3.2 多倍化诱发的DNA甲基化变化
• 3.3 多倍化诱发的基因表达变化
• 3.4 多倍化诱发基因表达变化的分子机制
• 4.本研究的背景
• 4.1 甜瓜属作物系统亲缘关系研究
• 4.2 甜瓜属远缘杂交现状
• 5.本文研究的提出及意义
• 5.1 目前研究存在的问题
• 5.2 本项目研究的科学意义
• 下篇 研究报告
• 1及异源双二倍体减数分裂染色体行为与花粉育性研究'>第二章 远缘杂种F₁及异源双二倍体减数分裂染色体行为与花粉育性研究
• 摘要
• Abstract
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 1及双二倍体各自交世代花粉母细胞减数分裂染色体构型'>2.1 杂种F₁及双二倍体各自交世代花粉母细胞减数分裂染色体构型
• 1及双二倍体各自交世代减数分裂四分体时期特点'>2.2 杂种F₁及双二倍体各自交世代减数分裂四分体时期特点
• 1及双二倍体各自交世代的花粉活力'>2.3 杂种F₁及双二倍体各自交世代的花粉活力
• 3 讨论
• 1减数分裂细胞学特征与花粉活力'>3.1 远缘杂种F₁减数分裂细胞学特征与花粉活力
• 3.2 异源双二倍体减数分裂细胞学特征与花粉育性
• 1及人工异源双二倍体早期基因组序列变化研究'>第三章 甜瓜属远缘杂种F₁及人工异源双二倍体早期基因组序列变化研究
• 1及人工异源双二倍体不同世代基因组序列变化'>第一节 甜瓜属远缘杂种F₁及人工异源双二倍体不同世代基因组序列变化
• 摘要
• Abstract
• 1 材料与方法
• 1.1 植物材料
• 1.2 DNA提取与AFLP分析
• 2 结果与分析
• 1及异源双二倍体基因组序列变化的时间'>2.1 远缘杂种F₁及异源双二倍体基因组序列变化的时间
• 1及异源双二倍体基因组序列变化频率'>2.2 远缘杂种F₁及异源双二倍体基因组序列变化频率
• 1及异源双二倍体基因组序列变化类型'>2.3 远缘杂种F₁及异源双二倍体基因组序列变化类型
• 1及异源双二倍体基因组序列的偏父性遗传'>2.4 远缘杂种F₁及异源双二倍体基因组序列的偏父性遗传
• 1及异源双二倍体基因组变化序列的特征'>2.5 远缘杂种F₁及异源双二倍体基因组变化序列的特征
• 3 讨论
• 1及异源双二倍体基因组序列丢失'>第二节 甜瓜属正反杂交F₁及异源双二倍体基因组序列丢失
• 摘要
• Abstract
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 DNA提取及AFLP分析
• 2 结果与分析
• 2.1 双亲基因组序列在正反杂交后代中的丢失频率
• 2.2 双亲基因组序列在正反交后代中的丢失类型
• 2.3 双亲基因组序列在正反交后代中丢失时间
• 3 讨论
• 第四章 甜瓜属远缘杂交及多倍化诱发基因组胞嘧啶甲基化变化特征研究
• 第一节 甜瓜属远缘杂交及多倍化诱发基因组胞嘧啶甲基化变化
• 摘要
• Abstract
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 DNA提取与MSAP分析
• 2 结果与分析
• 1及异源双二倍体基因组胞嘧啶甲基化模式变化'>2.1 远缘杂种F₁及异源双二倍体基因组胞嘧啶甲基化模式变化
• 1及异源双二倍体胞嘧啶甲基化变化的非随机性'>2.2 杂种F₁及异源双二倍体胞嘧啶甲基化变化的非随机性
• 2.3 异源双二倍体自交各世代基因组胞嘧啶甲基化变化
• 3 讨论
• 3.1 基因组杂合性和（或）多倍性与胞嘧啶甲基化模式的调整
• 3.2 胞嘧啶甲基化模式变化的非随机性
• 第二节 甜瓜属远缘杂交及多倍化诱发甲基化变化位点的特性
• 摘要
• Abstract
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 MSAP特异条带的回收
• 1.3 叶片总RNA提取及双链cDNA合成
• 1.4 引物设计、PCR或RT-PCR反应体系和程序
• 1.5 Southern blot分析
• 2 结果与分析
• 2.1 胞嘧啶甲基化变化序列的特征性
• 2.2 PCR及RT-PCR分析
• 2.3 Southern blot分析
• 3 讨论
• 第三节 甜瓜属组织培养对胞嘧啶甲基化变化的影响
• 摘要
• Abstract
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 DNA提取与MSAP分析
• 2 结果与分析
• 2.1 ‘长春密刺'胚胎拯救获得再生苗
• 2.2 ‘长春密刺'组培苗及实生苗胞嘧啶甲基化水平
• 2.3 ‘长春密刺'组培苗及实生苗胞嘧啶甲基化模式
• 2.4 ‘长春密刺'组培苗单株之间胞嘧啶甲基化模式
• 3 讨论
• 全文讨论
• 全文结论
• 本论文创新点
• 参考文献
• 致谢
• 攻读博士期间发表的论文