抗病相关基因转化马铃薯及其表达的初步研究

论文摘要

试验首先建立马铃薯的遗传转化体系,再用农杆菌介导法将从辣椒中分离获得的抗菌蛋白基因、非特异性脂转移蛋白基因和亲环蛋白基因所构建的表达载体对马铃薯普通栽培种“津引8号”、“东农303”、“紫花851”进行了遗传转化,获得了抗性再生植株,对所获得的转基因苗进行了初步的分子鉴定,为进一步开展转基因抗病马铃薯株系的筛选奠定了基础。试验主要结果:（1）以马铃薯普通栽培种“津引8号”、“紫花851”、“东农303”的脱毒试管苗的茎段为外植体,“东农303”通过MS+1 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+0.2 mg/L GA3+0.05 mg/L KT诱导愈伤组织,MS+1 mg/L 6-BA+5 mg/L GA3再生不定芽;“滓引8号”、“紫花851”通过MS+2mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA诱导愈伤组织,MS+1 mg/L 6-BA+5 mg/L GA3再生不定芽;以1/2 MS作为各马铃薯生根培养基。以75 mg/L的Kan作为愈伤诱导和分化出芽的选择压;以50 mg/L的Kan作为生根的选择压;以200 mg/L进口的Cef作为脱菌抗生素。（2）根癌农杆菌介导的马铃薯遗传转化的最佳条件是:茎段外植体在愈伤诱导培养基上预培养2 d,农杆菌浓度OD600值为0.5,侵染10 min,25℃、黑暗条件下共培养3 d。采用前期选择可提高工作效率。选择生长状况良好的外植体;共培养时在培养基中添加50umol/L的AS;预培养和共培养时在培养基中添加2200 mg/L CaCl2;均可提高转化率。（3）获得5株“东农303”、3株“紫花851”、6株“津引8号”的转抗菌蛋白基因的转化植株;4株“东农303”、5株“紫花851”、5株“津引8号”转非特异性脂转移蛋白基因的转化植株;6株“东农303”、3株“紫花851”、5株“津引8号”转亲环蛋白基因的转化植株。PCR检测表明转化植株均扩增出相应的基因目的片段,证明基因已导入受体基因组中。（4）初步的抗性分析表明,部分转化体对马铃薯晚疫病抗性有一定的增强,抗菌蛋白、非特异性脂转移蛋白和亲环蛋白基因的导入增强了马铃薯的抗菌性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩写及中英文对照
• 1 前言
• 1.1 研究的目的和意义
• 2 文献综述
• 2.1 几种常用的基因转化方法
• 2.1.1 农杆菌介导转化法
• 2.1.2 基因枪介导法
• 2.1.3 花粉管通道法
• 2.1.4 PEG法
• 2.2 马铃薯转基因研究现状
• 2.2.1 抗真菌病的研究
• 2.2.1.1 Harpin蛋白基因和prp.1基因的作用
• 2.2.1.2 几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶基因的利用
• 2.2.1.3 利用其他植物的抗病基因
• 2.2.1.4 小抗茵肽的开发利用
• 2.2.1.5 活性氧产生酶基因的利用
• 2.2.2 抗病毒的研究
• 2.2.2.1 CP基因在马铃薯抗病毒病中的应用
• 2.2.2.2 利用病毒复制酶基因介导的抗病性
• 2.2.2.3 核酶基因介导的抗性
• 2.2.2.4 RNA和反义RNA介导的抗性
• 2.2.2.5 马铃薯自身的抗病基因
• 2.2.3 抗细菌病研究
• 2.2.4 抗虫性的研究
• 2.2.5 改良品质的研究
• 2.2.6 作为生物反应器的研究
• 2.2.7 转基因植株的筛选与检测
• 2.2.7.1 转基因植株的筛选
• 2.2.7.2 转基因植株的检测
• 2.2.8 转基因马铃薯的生物安全性评价和展望
• 2.2.8.1 生态环境安全性
• 2.2.8.2 食品安全性
• 3 材料和方法
• 3.1 供试材料
• 3.2 农杆菌培养和菌液制备
• 3.2.1 菌株培养
• 3.2.2 菌液制备
• 3.3 马铃薯基因转化受体系统的建立
• 3.3.1 获得一致的基础苗
• 3.3.2 马铃薯高频再生系统的建立
• 3.3.2.1 培养方法
• 3.3.2.2 供试培养基配方
• 3.3.3 脱菌抗生素的筛选
• 3.3.4 马铃薯外植体对卡那霉素敏感性试验
• 3.3.4.1 愈伤组织诱导阶段Km选择压的确定
• 3.3.4.2 生根过程中Km选择压的确定
• 3.4 根癌农杆菌介导的马铃薯遗传转化
• 3.4.1 外植体的预培养
• 3.4.2 农杆菌浓度和侵染时间的确定
• 3.4.3 共培养时间的确定
• 3.4.4 选择培养方法的确定
• 3.4.5 其它因素对转化的影响
• 3.5 转化植株的分子检测
• 3.5.1 简易法小量提取基因组DNA
• 3.5.2 抗性马铃薯的PCR检测
• 3.5.3 PCR产物的凝胶电泳
• 3.6 转化植株抗病性的初步鉴定
• 4 结果分析
• 4.1 马铃薯基因转化受体系统的建立
• 4.1.1 马铃薯高频再生系统的建立
• 4.1.2 脱菌抗生素的筛选
• 4.2 马铃薯外植体对卡那霉素敏感性试验
• 4.2.1 愈伤组织诱导阶段Km选择压的确定
• 4.2.2 生根过程中Km选择压的确定
• 4.3 根癌农杆菌介导的马铃薯遗传转化
• 4.3.1 外植体的预培养
• 4.3.2 农杆菌浓度和侵染时间的确定
• 4.3.3 共培养时间的确定
• 4.3.4 选择培养方法的确定
• 4.3.5 其它因素对转化的影响
• 4.3.5.1 外植体的生理状况对转化的影响
• 4.3.5.2 外植体类型对转化的影响
• 4.3.5.3 AS对转化的影响
• 2+对转化的影响'>4.3.5.4 Ca²⁺对转化的影响
• 4.4 转化植株的分子检测
• 4.5 转化植株抗病性的初步鉴定
• 5 结论与展望
• 5.1 主要结论
• 5.2 主要创新点
• 5.3 展望
• 参考文献
• 附录1 MS培养基配方
• 附录2 主要仪器
• 附录3 主要试剂
• 附录4 试剂与缓冲液的配制
• 附录5 DNA Marker示意图
• 附图1-12
• 致谢