棕色固氮菌突变株DJ194和UW3中固氮酶蛋白的研究

论文摘要

用0.26 mol／L NaCl从吸附有粗提物的DEAE柱洗脱的组分经Q-Sepharose柱用0.15-0.40mol／L NaCl缓冲液线形梯度洗脱，再经Sephacryl S-200柱、Q-Sepharose柱进一步纯化浓缩，所得蛋白组分命名为ΔnifZAv2Q2。它在SDS凝胶电泳胶上的主要蛋白带的相对迁移率比部分纯的OP Av2中分子量为32kDa的条带略大些，在天然电泳中比OP Av2具有更高的迁移率。通过鉴定该制备物为一种具有与OP Av2相似亚基组成的固氮酶Fe蛋白。它与OP Av1重组的乙炔还原活性(6052 nmol C2H4·min-1·mg蛋白-1)远高于与OP Av2重组的活性。该铁蛋白与OP Av1重组的乙炔还原活性，H+和N2（以在氩气和氮气下放氢的差值表示）还原活性，均约为与OP Av2重组的活性的2.2倍。这些表明，该铁蛋白也许具有一般固氮酶Av2所不具的结构和功能特性，使它表现出高还原活性、与先前纯化得到的ΔnifZAv2不同的电泳迁移率和低的盐洗脱浓度。经DEAE-52，Q-Sepharose和Sephacry S-200柱厌氧层析，从棕色固氮菌突变株UW3纯化得到CrFe蛋白制备物。其中～50％的蛋白具有与从野生型固氮菌OP的MoFe蛋白（OP Av1）相似的亚基组成，并可与OP Av1的抗体发生免疫交叉反应。该制备物还具有～40％的OP Av1 C2H2，H+和N2（以在氩气和氮气下放氢的差值表示）还原活性，并具与OP Av1相似的电子对比率。金属分析表明，这蛋白制备物含有Fe，Cr和Mo。与OP Av1相比，该制备物在450 nm的圆二色谱（CD）与之相似，但在3个相同g值处（g≈4.3，3.7和2.0）出现的EPR信号相对强度则不相同。以上结果表明，CrFe蛋白也许是一种新的固氮酶组分Ⅰ蛋白，除以Cr代替Mo外，它的功能和包括金属原子簇在内的结构都可能与MoFe相似。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 第一章 前言
• 1.1 固氮酶的生物化学
• 1.1.1 固氮酶的结构组成
• 1.1.1.1 MoFe蛋白
• 1.1.1.2 Fe蛋白
• 1.1.1.3 固氮酶的多样性
• 1.1.2 固氮酶的特性
• 1.1.2.1 固氮酶的稳定性与异种两组分的交叉互补性
• 1.1.2.2 底物还原特性
• 1.1.2.3 固氮酶的活性调节
• 1.1.2.4 金属原子簇的波谱学研究
• 1.2 固氮酶的分子生物学研究
• 1.2.1 固氮基因
• 1.2.2 调控基因
• 1.2.3 突变株固氮酶蛋白的研究
• 1.2.3.1 FeMoco合成或活性受到影响的突变株
• 1.2.3.2 P-cluster特性异常的突变株
• 1.3 可能存在的新型固氮酶——含Cr的固氮酶
• 1.4 选题依据和意义及研究思路
• 第二章 材料与方法
• 2.1 菌种及培养
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 培养基配制
• 2.1.3 菌体培养
• 2.2 厌氧技术
• 2.3 固氮酶提取及纯化
• 2.3.1 缓冲液的配制
• 2.3.2 提取和纯化过程
• 2.3.2.1 野生种OP固氮酶MoFe蛋白和Fe蛋白的分离纯化
• 2.3.2.2 DJ194固氮酶MoFe蛋白（ΔnifZ Avl）的分离纯化
• 2.3.2.3 突变种UW3/Cr固氮酶CrFe蛋白的分离纯化
• 2.4 蛋白质浓度测定
• 2.5 蛋白质电泳及免疫印迹
• 2.5.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
• 2.5.2 厌氧天然PAGE
• 2.5.3 免疫印迹
• 2.6 固氮酶活性测定
• 2.6.1 MgATP发生系统的配制
• 2.6.2 固氮酶MFe蛋白活性测定
• 2.7 蛋白质样品中的金属含量测定
• 2.8 波谱分析
• 2.8.1 质谱测定
• 2.8.2 圆二色谱测定
• 2.8.3 电子顺磁共振谱测定
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 高纯度和高活性的⊿nifZ Av2的分离纯化和特性
• 3.1.1 层析柱盐洗脱行为和电泳
• 3.1.2 亚基组成和金属含量
• 3.1.3 底物还原活性
• 3.1.4 氧敏感性和冷失活研究
• 3.1.5 实验结果与理论计算值的对应
• 3.2 棕色固氮菌突变株UW3中CrFe蛋白的分离纯化和特性
• 3.2.1 电泳行为
• 3.2.2 底物还原活性和金属组成
• 3.2.3 圆二色（CD）谱
• 3.2.4 EPR特性
• 3.2.5 CrFe蛋白中金属原子簇的结构模型
• 第四章 小结与展望
• 4.1 小结
• 4.2 研究展望
• 参考文献
• 致谢