二级三维多孔天然胶原—羟基磷灰石骨组织工程复合支架材料的体外构建及其生物性能研究

论文摘要

由交通事故、建筑事故、工伤、肿瘤及各种疾病导致的骨缺损病人数量日益增加。目前,最常应用的自体移植虽能较快的修复骨缺损,但自然资源相当有限；作为外科骨重建基本方法的脱钙骨基质缺乏自体骨所具有的生物活性,而且可能会有携带疾病的危险并有免疫排斥反应。传统的生物材料,包括生物陶瓷、玻璃、金属和高分子材料,因为不具有生物活性,对骨组织进行修复之后,会产生许多固有的问题,如结合差、磨损、腐蚀,特别是无法形成“活”的具有生物功能的骨组织,难以从根本上解决患者的痛苦和实现缺损部位的功能。组织工程为骨缺损修复提供了一种最佳的解决方案。国内外生物材料科学工作者在骨组织工程支架材料方面进行了大量的研究工作,也取得了一定的研究成果,并且某些产品已经应用于临床,但目前仍存在大量问题,陶瓷材料难以降解,聚乳酸（PLA）和聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）降解产物为酸性,不利于新组织的生长。胶原蛋白-羟基磷灰石纳米晶复合支架材料具有良好的生物相容性和骨组织修复能力,可以真正实现“骨组织体内重建”,是一种有应用前景的骨组织工程支架材料。然而,高质量的胶原蛋白提纯成本高,并且需要去除末端肽以降低抗其原性,所以价格昂贵,这是材料难以推广应用的原因之一。此外,传统胶原海绵支架是将胶原溶解,通过戊二醛等交联剂进行交联重建得到的,而戊二醛会随着胶原支架在体内降解后释放,这可能会对机体产生毒性；高分子及其复合支架材料的初始强度都较低。因此,目前世界范围内迫切需要成本较低、生物活性高、可实现体内骨组织重建和初始强度高的高性能骨组织工程支架材料。猪皮脱细胞真皮基质（Porcine Acellular Dermal Matrix, PADM）已经作为皮肤修复材料用于烧伤和其它皮肤缺损的治疗,由于其良好的降解特性,天然的网络结构和优异的生物相容性和生物活性,取得了很好的治疗效果。而且PADM主要由Ⅰ型胶原组成,与骨组织主要有机组成相似。本研究以PADM为有机基质,纳米羟基磷灰石为无机组成,通过仿生矿化法制备了具有二级三维多孔结构,价格低廉,力学强度高,易于立体裁剪,可控生物降解,生物相容性好的PADM-羟基磷灰石（PADM—HAp）骨组织工程复合支架材料,并研究了其生物活性。本论文主要包括以下几个方面的工作：1.猪脱细胞真皮基质的提取及表征综合碱处理、酶处理、表面活性剂（SDS）处理和盐处理四种制备脱细胞真皮基质方法的优点,探索出了新的PADM制备工艺。苏木精—伊红（H&E）染色和扫描电镜（SEM）分析都表明采用本方法制备的支架材料中没有细胞残余,胶原的天然结构被完整保存。支架的连通孔结构及孔径大小随pH值改变而变化,傅里叶变换红外光谱（FTIR）结果表明PADM与市售的Sigma公司的高纯胶原的图谱一致。总氨基酸含量分析表明,随着酶浓度的增加,所制备的PADM支架中总氨基酸含量逐渐降低。随着酶浓度的增加及处理时间的增长,羟脯氨酸的含量升高,极限拉伸强度降低,PADM体外降解速率加快。2.二级三维多孔结构PADM-HAp复合支架的体外构建及表征猪脱细胞真皮基质为软组织来源,而且在提取过程中,天然胶原结构被完整保存,胶原分子中氨基酸残基较少,因此原胶原分子表面有利于无机纳米羟基磷灰石（HAp）成核的活性位点变少。基于此,本研究提出了两步矿化法,即预钙化和模拟体液中（SBF）中仿生矿化。预钙化过程对促进HAp在PADM支架中快速成核生长起到重要作用,而在SBF中仿生矿化过程有利于HAp纳米网络结构的形成。通过两步矿化过程将HAp纳米结构组装到PADM中,构建了具有二级三维网络结构的HAp-PADM支架。在SBF中矿化15天后的HAp-PADM支架,不仅保存了来源于天然PADM的大孔（>100μm）,而且在大孔的孔壁表面自组装形成HAp纳米结构网络（<100nm）。对于干燥状态的PADM及在SBF中矿化不同时间的PADM进行机械性能分析,结果表明干支架的抗压弹性模量随着HAp含量的增加而增大。十五天矿化后得到的PADM-HAp复合支架（S15D）经过磷酸盐缓冲溶液（PBS,pH=7.4）浸湿12小时后支架的压缩弹性模量高达600 kPa,是传统方法制备的HAp-胶原海绵材料的上百倍。激光共聚焦显微镜（CLSM）观察和细胞毒性实验（MTT）结果显示MC3T3-E1细胞在纯PADM和S15D支架上有相似的细胞形貌和增殖行为,表明S15D有较高的机械强度和良好的细胞相容性。3.二级三维PADM-HAp网络结构形成机理研究对两步矿化过程中片状羟基磷灰石在PADM中的形成过程进行了研究。FTIR和能谱分析（EDS）结果表明在预钙化过程中有Ca2+和HP042-被PADM支架所吸附,但它们并没有直接沉淀形成磷酸钙晶体,而是以离子的形式吸附在胶原分子表面。SEM观察结果显示矿化八天后有片状HAp晶体在PADM表面形成,高分辨电子显微镜（HRTEM）及电子衍射结果表明片状HAp晶体沿c-轴在PADM孔道表面生长。FTIR和热重/差热综合热分析（TG-DTA）证明该过程形成的羟基磷灰石为含碳酸盐磷灰石。本文在分子水平上对两步矿化过程进行了初步模拟,借助双电层（EDL）理论解释了预钙化过程中HP042-和Ca2+在胶原表面的吸附能够促进羟基磷灰石在PADM中快速形成。4. PADM-HAp复合支架的蛋白吸附性能研究及其对细胞活性的影响通过两步矿化法,改变生物矿化时间,制备出两种PADM-HAp[十天矿化PADM（S10D）,十五天矿化PADM（S15D）]复合支架,通过测量计算得PADM、S10D和S15D的孔隙率分别为87.5%、87.5%和80%。纤维蛋白原和白蛋白吸附实验表明PADM比S10D和S15D有更高的蛋白吸附能力,在4-12小时内蛋白吸附达到最大量。支架的蛋白吸附和脱附性能明显影响了MC3T3-E1细胞在支架上及支架周围的活性。对三种支架进行培养基预吸附,培养48天后,种植在PADM及S10D支架上的细胞表现出明显的增殖,而S15D支架上的细胞却因胎牛血清（FBS）浓度过底而没有增殖现象。结果表明,羟基磷灰石在支架中的含量增加减弱支架的FBS吸附能力。5. HAp-PADM的生物相容性及生物活性研究将不同矿化时间的支架材料移植到大鼠肌肉中进行体内生物相容性分析。H&E染色结果表明PADM、S10D和S15D都有良好的体内生物相容性。肌肉种植30天后,支架中都有不同程度的成血管现象,60天后,血管现象明显。羟基磷灰石在支架中含量越多,支架的降解速率越慢,体内种植60天后,PADM被完全降解掉,S10D被大部分降解,S15D中因含有较多纳米羟基磷灰石而在120天后才明显降解。支架材料移植到大鼠体内后,材料及降解产物都没有明显的免疫排斥反应。将PADM及S15D移植到大鼠下颌骨4 mm临界骨缺损处,15周后取出下颌骨缺损部位进行H&E、X光和Micro-CT分析,结果表明修复过程是由缺损周边向中间进行,羟基磷灰石在PADM中的的组装明显加快骨缺损修复。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 组织工程概述
• 1.3 骨组织工程
• 1.4 天然骨的结构
• 1.5 骨形成机理
• 1.6 生物矿化
• 1.7 传统的骨组织工程支架材料及制备技术
• 1.8 羟基磷灰石/胶原骨组织工程支架材料
• 1.8.1 胶原蛋白
• 1.8.2 羟基磷灰石
• 1.8.3 羟基磷灰石-胶原复合支架材料
• 1.9 脱细胞真皮基质
• 1.9.1 猪脱细胞真皮基质（PADM）
• 1.9.2 猪脱细胞真皮基质的处理技术
• 1.10 课题的提出及主要内容
• 参考文献
• 第二章 猪脱细胞真皮基质的提取及表征
• 2.1 引言
• 2.2 天然猪皮胶原的提取
• 2.2.1 实验仪器
• 2.2.2 实验过程
• 2.3 结果与讨论
• 2.4 本章小结
• 参考文献
• 第三章 二级三维网络结构天然胶原-羟基磷灰石骨组织工程复合支架材料的构建及表征
• 3.1 引言
• 3.2 二级三维网络结构PADM-HAp复合支架的构建
• 3.2.1 实验原料
• 3.2.2 实验过程
• 3.2.3 实验结果
• 3.3 讨论
• 3.4 本章小结
• 参考文献
• 第四章 二级三维网络结构天然胶原-羟基磷灰石复合支架材料形成机理探讨
• 4.1 引言
• 4.2 材料的制备
• 4.2.1 实验原料
• 4.2.2 实验过程
• 4.2.3 分析手段
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 二级三维多孔PADM-HAp复合支架的形成过程
• 4.3.2 三维二级多孔结构的形成机理
• 4.4 本章小结
• 参考文献
• 第五章 二级三维网络结构天然胶原-羟基磷灰石骨组织工程复合支架材料的蛋白吸附性能研究
• 5.1 引言
• 5.2 二级三维网络结构PADM-HAp复合支架的蛋白吸附实验
• 5.2.1 实验原料
• 5.2.2 实验流程
• 5.2.3 测试方法
• 5.3 实验结果
• 5.3.1 复合支架的蛋白吸附性能
• 5.3.2 蛋白吸附的复合支架对细胞活性的影响
• 5.4 讨论
• 5.5 本章小结
• 参考文献
• 第六章 HAp-PADM复合支架的生物相容性及生物活性研究
• 6.1 引言
• 6.2 实验材料与方法
• 6.2.1 实验所需实验试剂与设备
• 6.2.2 材料选择及实验前准备
• 6.3 实验过程
• 6.3.1 大鼠肌肉种植
• 6.3.2 大鼠下颚骨修复
• 6.3.3 分析手段
• 6.4 结果与讨论
• 6.4.1 PADM，S10D，S15D复合支架材料在大鼠体内生物相容性研究
• 6.4.2 PADM和S15D复合支架材料对大鼠下颌骨临界骨缺损的修复性能研究
• 6.5 本章小结
• 参考文献
• 第七章 结论
• 7.1 主要结论
• 7.2 创新点
• 7.3 需要进一步开展的工作
• 攻读博士期间取得的科研成果及参与的科研项目
• 致谢
• 附录Ⅰ
• 学位论文评阅及答辩情况表