根癌农杆菌介导的盾叶薯蓣转化体系的建立

论文摘要

盾叶薯蓣（Dioscorea zingiberensis C.H.Wrigh t）,是我国特有的甾体激素类药源植物,也是世界上薯蓣皂甙元含量最高的资源植物。近些年,由于人类的过度采挖,野生盾叶薯蓣资源濒临枯竭,而人工栽培种存在皂甙元含量降低,种质退化等问题。细胞和基因工程技术可望为盾叶薯蓣的品种改良提供一个新的途径。本实验筛选了盾叶薯蓣易组织培养的基因型,并以其三种外植体—幼胚诱导的胚性愈伤,花序愈伤和花序作为转化受体,研究了根癌农杆菌介导的盾叶薯蓣转化的各种影响因素,获得了转基因植株,初步建立了根癌农杆菌介导的盾叶薯蓣转化体系,为通过转基因技术对其进行品种改良的研究奠定了技术基础。主要研究结果如下:一、转化受体的准备1.基因型筛选。利用盾叶薯蓣四种基因型的幼胚进行了愈伤诱导实验,结果表明:不同基因型的组织培养能力不同,田间编号为4—73的材料最易进行组织培养,幼胚愈伤诱导率最高,达95.3%;其次是4—61,诱导率为91.2%;然后是5—88,诱导率为76.3%;4—72几乎没有诱导出愈伤。选择最容易组织培养的4-73作为以后研究的材料。2.幼胚来源的愈伤继代和状态改良。4-73的幼胚诱导出来的初代愈伤,不成颗粒,生长缓慢,而且水浸状严重,再生困难,难以直接进行转化研究。通过调节激素种类与浓度、基本培养基成分,有机添加物,改变继代方式等,经过长时间的改良后,产生了白黄色,致密,表面呈颗粒的胚性愈伤。3.花序愈伤诱导。取4-73幼嫩的花序,在MS附加0.5 mg/L 2,4-D,1.0 mg/L 6-BA或0.2 mg/L 2,4-D,1.0 mg/L 6-BA两种培养基上,均能诱导出高质量的愈伤。二、影响转化的主要因素研究1.外植体类型对转化的影响。利用4-73幼胚来源的胚性愈伤、花序诱导的愈伤以及花序三种外植体,分别与农杆菌共培养后,比较GFP的瞬间转化率。幼胚来源的胚性愈伤转化率最高,达到49.3%;花序愈伤转化率次之,达到40.5%;花序的瞬间转化率最低,只有5.5%,不适合直接作为转化的受体。2.预培养对转化的影响。分别用幼胚来源的胚性愈伤和花序愈伤两种外植体作为转化受体,比较预培养与否时,GFP的瞬间转化率。结果表明:两种外植体经过预培养均比不经过预培养时转化率要高,预培养对转化有利。3.预培养基和共培养基成分对转化的影响。通过MS,1/4MS和去掉CaCl2的MS三种基本培养基作为预培养和共培养基。结果发现,去掉CaCl2的MS最适合用作预培养和共培养的基本培养基。4.AS对转化的影响。通过是否添加200μmol/L AS时的GFP瞬间转化率比较,发现预培养和共培养阶段,培养基中添加200μmol/L AS有利于提高转化率。5.农杆菌浸染浓度对转化的影响。分别用OD600为0.3,0.5,0.8的农杆菌浸染液,感染胚性愈伤后,比较GFP瞬间转化率,结果显示,盾叶薯蓣转化的最佳菌液浓度为OD600=0.5。6.共培养时间对转化的影响。用幼胚胚性愈伤作为受体,分别统计共培养1 d、2 d、3 d、4 d后,GFP的瞬间转化率。结果表明,共培养3 d时瞬间转化率最高。7.转化参数的验证。以幼胚胚性愈伤和花序愈伤为受体,利用含有GUS报告基因载体的农杆菌EHA105介导,按照以上得出的转化参素进行转化,验证转化参数是否合适。结果显示:两种受体共培养后,经过GUS染液染色过夜,在大部分外植体上都观察到蓝斑,从而验证了前面得出的转化参数是正确的。三、转化细胞的筛选、扩繁和再生,以及转基因植株PCR的鉴定1.潮霉素筛选浓度的确定。将胚性愈伤转到含有潮霉素9个浓度梯度的培养基上,生长1个月后,观察愈伤在各个浓度上的生长状态,以确定潮霉素的筛选浓度。结果显示:在盾叶薯蓣转化实验中,合适的潮霉素筛选浓度为70mg/L。2.转化细胞的筛选、扩繁和再生。共培养后,将各外植体转到响应的筛选培养基上,经过1-2个月的筛选,只有幼胚来源的胚性愈伤作为受体,进行转化后,产生了抗性愈伤,抗性愈伤在不含抗生素的培养基上扩繁两次,在再生培养基上分化出8棵拟转化苗。3.转基因植株的GFP绿色荧光表达检测。将上面所得的拟转化苗进行扩繁后,在荧光体式显微镜下观察,发现在叶和叶柄上有微弱的绿色荧光表达。4.转基因植株的PCR鉴定。提取扩繁后拟转化苗的总DNA,用潮霉素引物扩增出了潮霉素基因片段,说明筛选过程是严谨的,获得了转化的转基因植株。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 1 前言
• 1.1 课题的提出
• 1.2 根癌农杆菌介导的植物转基因概述
• 1.2.1 根癌农杆菌的研究简史
• 1.2.2 根癌农杆菌生物学特性
• 1.2.3 根癌农杆菌转基因研究的发展
• 1.2.4 根癌农杆菌介导的遗传转化影响因素
• 1.2.4.1 建立高效的盾叶薯蓣组织培养体系
• 1.2.4.2 受体植株
• 1.2.4.3 农杆菌类型和质粒
• 1.2.4.4 预培养
• 1.2.4.5 基因活化的诱导物
• 1.2.4.6 外植体的接种和共培养
• 1.2.4.7 培养基的成分
• 1.2.4.8 渗透处理
• 1.2.4.9 干燥
• 1.2.4.10 转化细胞的选择培养和再生
• 1.2.5 外源基因的整合和表达鉴定
• 1.3 本研究的目的和意义
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 组织培养体系优化中用到的盾叶薯蓣
• 2.1.2 组织培养体系优化中用到的培养基
• 2.1.3 实验所用的菌株和质粒
• 2.1.4 转化实验中用到的培养基
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 幼胚愈伤的准备
• 2.2.2 花序愈伤的准备
• 2.2.3 农杆菌的活化、培养
• 2.2.4 潮霉素有效筛选浓度实验
• 2.2.5 外植体类型对转化的影响
• 2.2.6 预培养对转化的影响
• 2.2.7 AS的有无对转化的影响
• 2.2.8 农杆菌浸染浓度对转化的影响
• 2.2.9 共培养时间对转化的影响
• 2.2.10 报告基因的瞬间表达检测
• 2.2.11 抗性愈伤的筛选和转化植株的再生
• 2.2.12 转基因植株的GFP表达检测
• 2.2.13 转基因植株的PCR鉴定
• 3 结果与分析
• 3.1 基因型对组织培养的影响
• 3.2 幼胚来源的胚性愈伤的诱导和改良
• 3.3 花序愈伤的诱导
• 3.4 潮霉素筛选浓度的确定
• 3.5 不同外植体对转化的影响
• 3.6 预培养对转化的影响
• 3.7 预培养基和共培养基对转化的影响
• 3.8 AS对转化的影响
• 3.9 农杆菌浸染浓度对转化的影响
• 3.10 共培养时间对转化的影响
• 3.11 转化参数的验证
• 3.12 抗性愈伤的筛选和再生
• 3.13 转化植株的PCR鉴定及GFP表达检测
• 3.14 转化体系的建立
• 4 讨论
• 4.1 报告基因的选择
• 4.2 外植体类型对盾叶薯蓣转基因的影响
• 4.3 农杆菌浸染液浓度对盾叶薯蓣转基因的影响
• 4.4 基本培养基对盾叶薯蓣转基因的影响
• 4.5 影响盾叶薯蓣转基因的其他因素
• 4.6 关于转基因体系的建立
• 5 结论
• 参考文献
• 图版和图版说明
• 致谢