猪传染性胃肠炎病毒TaqMan荧光定量RT-PCR方法的建立及初步应用

论文摘要

猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus of swine, TGEV）主要引起猪传染性胃肠炎（Transmissible gastroenteritis,TGE）, TGE是一种高度接触性的肠道传染病,主要是引起仔猪呕吐、腹泻、脱水以及消瘦等,并且能够造成仔猪死亡,尤其对两周龄以内的仔猪造成的危害最大,死亡率能够达到100%。该病主要爆发于冬季以及早春时节,传播迅速,给养猪业带来巨大的损失。目前实验室对TGEV病原主要是通过常规RT-PCR来检测,而常规的RT-PCR相对于荧光定量RT-PCR,灵敏性较低。常规RT-PCR适用于发病严重的仔猪,而对于潜伏感染或者感染早期,则需要灵敏性更高的检测方法来实现,从而在猪感染早期即可采取有效的防控以减少TGE的爆发带来的损失。本实验主要是为临床检测建立灵敏性更高的TaqMan荧光定量RT-PCR方法。通过对TGEV高度保守的N蛋白基因序列和GenBank上已经发布的序列进行比较,选择突变小的区域,设计引物和探针,并通过克隆制备出阳性标准品,通过得到的标准曲线得知,反应模版的浓度与荧光定量的CT值具有很好的线性关系,其直线方程为y=-3.15181gx+51.613,相关系数达到0.997,且该方法具有很高的灵敏度和很好的特异性。它能够检测出最低的TGEV的DNA含量为1.445×10-6ng/μL。同时通过与常规RT-PCR方法进行比较,得到该方法的敏感性比常规RT-PCR方法要高出约100倍。由于检测方法敏感性比常规RT-PCR方法更高,因此对猪群的早期感染更能做出准确的判断,对预防和防治TGE的爆发能够起到重要作用。同时,针对TGE的防治,目前临床上主要采取疫苗免疫来进行,其他药物等只能起到一个提高机体的抵抗力以及防止继发感染等的辅助作用。因此疫苗接种免疫对TGE的预防和治疗显得尤为重要。本实验室以沙门氏菌为载体,构建了一个猪传染性胃肠炎的基因工程活疫苗,然后进行动物免疫保护性试验。选取TGEV阴性的42头猪,分成4组：非免疫组、空质粒免疫组,基因工程疫苗组和正常对照组。通过免疫后冉人工攻毒,进行免疫保护性试验。临床症状表明,非免疫组以及空载体攻毒组表现出严重的TGE症状,而基因工程疫苗组临床症状表现不明显。通过HE然后能够发现,非免疫组以及空质粒免疫组小肠出现严重病变,肠绒毛坏死,脱落等严重,同时应用免疫组化和荧光定量RT-PCR方法检测,发现病毒主要集聚在小肠,这就证明了病猪在感染TGEV后,主要出现腹泻、脱水及消瘦等症状。通过动物试验,能够得出该基因工程活疫苗对仔猪具有很好的保护性。同时通过荧光定量对各组织病毒的检测,得出了TGEV在猪体内的分布情况。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略表（Abbreviation）
• 1. 文献综述
• 1.1 TGEV的病原结构
• 1.2 TGEV的理化特性
• 1.3 TGEV的培养特性
• 1.4 TGEV的研究进展
• 1.5 TGEV的流行病学
• 1.6 临床症状
• 1.7 病理变化
• 1.8 致病机理
• 1.9 TGEV的诊断方法研究进展
• 1.9.1 病毒分离鉴定
• 1.9.2 病毒电镜检测
• 1.9.3 血清学诊断
• 1.9.4 分子学诊断
• 1.9.4.1 核酸探针杂交技术
• 1.9.4.2 免疫胶体金标记技术
• 1.9.4.3 PCR技术
• 1.9.4.4 荧光定量RT-PCR
• 2. 目的与意义
• 3. 材料与方法
• 3.1 材料
• 3.1.1 病毒与菌株
• 3.1.2 试验动物与疫苗
• 3.1.3 主要仪器
• 3.1.4 主要试剂和药品
• 3.1.5 主要培养基的配制
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 引物与探针的设计
• 3.2.2 病毒核酸的提取
• 3.2.2.1 DNA病毒Total DNA的提取
• 3.2.2.2 RNA病毒Total RNA的提取
• 3.2.2.3 DNA的合成
• 3.2.3 阳性标准质粒的制备
• 3.2.3.1 引物的设计
• 3.2.3.2 目的片段带的扩增
• 3.2.3.3 扩增产物的回收与纯化
• 3.2.3.4 纯化产物与载体的连接
• 3.2.3.5 转化
• 3.2.3.6 质粒的大量提取
• 3.2.3.7 质粒的鉴定
• 3.2.4 实时定量RT-PCR反应体系的建立
• 3.2.5 标准曲线制备
• 3.2.6 特异性试验
• 3.2.7 敏感性试验及重复性试验
• 3.2.8 人工动物试验
• 3.2.9 实时荧光定量RT-PCR
• 3.2.9.1 试验动物组织中病毒RNA的提取
• 3.2.9.2 荧光定量RT-PCR检测
• 3.2.10 组织切片制备
• 3.2.11 HE染色
• 3.2.12 免疫组化法检测试验猪的病毒含量情况
• 4. 结果与分析
• 4.1 标准质粒的制备
• 4.2 荧光定量RT-PCR反应体系的建立及标准曲线的制备
• 4.3 特异性试验
• 4.4 敏感性试验
• 4.5 符合率试验
• 4.6 TGEV的流行病学调查
• 4.7 人工动物试验
• 4.8 荧光定量RT-PCR检测人工感染猪体内病毒的分布
• 4.9 HE染色检测
• 4.10 免疫组化法对病毒的检测
• 5. 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢