稀有鮈鲫Foxl2和斑马鱼Zar1L基因克隆及其时空表达分析

论文摘要

稀有鮈鲫（Gobiocypris rarus）是我国特有的实验动物,其性别决定机制还不清楚。为了研究稀有鮈鲫性别决定的分子基础,本实验通过RT-PCR和cDNA末端快速克隆（SMART RACE）相结合的方法从稀有鮈鲫卵巢中克隆了Foxl2全长cDNA序列。稀有鮈鲫Foxl2 cDNA序列全长为1700bp,其中5’非编码区221bp,3’非编码区558bp,开放式阅读框921bp,共编码306个氨基酸残基,包括由90个氨基酸组成的FH结构域（FH-domain）。将稀有鮈鲫FOXL2序列与其他物种FOXL2进行同源性比对,结果显示脊椎动物FOXL2 FH结构域保守性最高,并且C-末端的保守性要高于N-末端。比较发现,稀有鮈鲫FOXL2同其它非哺乳类的脊椎动物一样,不包含聚丙氨酸,也不包含富含甘氨酸—脯氨酸区域。RT-PCR分析Foxl2基因在稀有鮈鲫各组织中的表达模式,发现该基因在眼、脑、鳃和性腺表达,肝、肠和肌肉也有微弱表达,卵巢的表达量远高于精巢。这种表达模式表明Foxl2的靶组织可能在脑—垂体—性腺轴上。雌二醇（E2）和二甲基睾酮（MT）用酒精配制终浓度为0.01μ/l,分别对出苗约1个月稀有鮈鲫幼苗处理30天后换正常曝气水饲养10天,每10天每组各提取3条幼鱼总RNA。用荧光定量PCR检测Foxl2的表达水平变化。结果显示,与对照相比,E2处理组30-40d Foxl2表达升高,而MT处理组的表达降低,表明Foxl2的表达受下游性激素的反馈调控。母源性mRNA在卵母细胞中表达,在胚胎发育的早期过程中起重要作用。合子阻滞基因1 （Zygote arrest 1, Zar1）及Zar1-like （Zar1L）作为母源基因,在小鼠卵子—合子转变过程中发挥着极其重要的作用。Zar1及Zar1L在进化中保守,但Zar1在不同动物中的表达模式不尽相同。本研究以斑马鱼为对象,采用RACE技术获得了Zar1L cDNA全长,并采用RT-PCR技术检测Zar1和Zar1L在斑马鱼不同组织器官、卵母细胞和胚胎发育时期的表达情况。Zar1L cDNA的全长为1146bp,编码311个氨基酸残基,5’非编码区20bp,3’非编码区190bp。多重序列比对结果显示,C-末端的序列非常保守,Zar1和Zar1L C-末端的相似性高达74%,具有非典型的PHD结构域（plant homeo domain）,并具有两个C4类型的锌指结构。在基因结构上,Zar1和Zar1L均由四个外显子构成,两个基因的每一个外显子在大小上也比较相近。分子进化表明,斑马鱼Zar1和Zar1L属于两个不同的基因,可能是同一来源的祖先基因重复和进化的结果。RT-PCR结果表明,斑马鱼Zar1和Zar1L的表达模式相似,都是卵巢特异表达的基因,在卵母细胞及早期胚胎中可检测到大量转录本的存在,囊胚、原肠胚期后下降,但在整个胚胎发育期都可检测到转录本。斑马鱼Zar1和Zar1L mRNA的表达水平的一致性,似乎暗示着两个基因的功能基本一致。表达模式分析表明,Zar1和Zar1L可能与斑马鱼卵子—合子转变有关,也可能与其他的胚胎发育过程有关。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1. 前言
• 1.1 鱼类的性别决定与性别分化
• 1.1.1 鱼类性别决定和性别分化相关基因简介
• 1.1.2 斑马鱼性别决定和性别分化的信号通路
• 1.1.3 外源激素对鱼类性别分化的影响
• 1.2 母型—合子型过渡
• 1.3 本项目的立项依据、目的和意义
• 2. 材料与方法
• 2.1 实验材料和引物序列
• 2.2 主要仪器设备
• 2.3 主要试剂
• 2.4 实验方法
• 2.4.1 实验鱼的处理和实验材料的获得
• 2.4.2 RNA的提取
• 2.4.3 DNase Ⅰ消化总RNA
• 2.4.4 cDNA第一链的合成
• TM RACE克隆基因全长'>2.4.5 SMART^TMRACE克隆基因全长
• 2.4.6 PCR产物纯化回收
• 2.4.7 DH5α感受态细胞的制备
• 2.4.8 目的DNA片段与pMD18-T载体连接
• 2.4.9 连接产物转化和阳性克隆筛选
• 2.4.10 序列分析
• 2.4.11 RT-PCR时空表达分析
• 2.4.12 Real-Time PCR检测Foxl2基因表达水平
• 2.4.13 RNA探针标记
• 2.4.14 胚胎整体原位杂交
• 3. 结果
• 3.1 稀有鮈鲫FOXL2基因的克隆及序列分析
• 3.1.1 稀有鮈鲫Foxl2基因保守片段的克隆
• 3.1.2 RACE-PCR扩增Foxl2的全长
• 3.1.3 FOXL2同源性分析
• 3.1.4 稀有鮈鲫Foxl2的组织表达分析
• 3.1.5 性激素处理对稀有鮈鲫Foxl2表达的影响
• 3.2 斑马鱼Zar1L基因的克隆及序列分析
• 3.2.1 RACE-PCR扩增Zar1L基因的全长
• 3.2.2 Zar1L的cDNA同源性分析
• 3.2.3 系统进化分析
• 3.2.4 斑马鱼Zar1和Zar1L组织表达分析
• 3.2.5 斑马鱼Zar1和Zar1L在卵子发生时期的表达
• 3.2.6 斑马鱼Zar1和Zar1L在胚胎发育时期的表达
• 3.2.7 Zar1和Zar1L在胚胎不同发育阶段的表达特征
• 4. 讨论
• 4.1 稀有鮈鲫Foxl2基因的序列分析及表达模式分析
• 4.2 斑马鱼Zar1L基因的序列分析及表达模式分析
• 参考文献
• 在校期间论文发表情况
• 致谢