大麦虫幼虫超氧化物歧化酶分离提纯工艺及酶学性质研究

论文摘要

超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,简称SOD）,是一种专一催化超氧阴离子自由基（O2-·）发生歧化反应的金属酶,具有抗癌、抗辐射、抗衰老等作用,在医学、农业、食品与化妆品工业上具有广泛的应用价值。大麦虫营养价值很高,是一种不可多得的蛋白源昆虫,但长期以来对其缺乏系统深入的研究,因此粗加工利用较多,而精深开发利用较少,大量的营养资源被浪费。本研究以大麦虫幼虫作为实验材料,对其SOD的提取、纯化工艺及酶学性质进行研究,旨在寻找新的SOD来源,并为大麦虫幼虫SOD的工业化生产提供理论依据。主要研究结果如下:（1）在单因素试验的基础上,采用中心组合试验优化大麦虫幼虫SOD的工艺。结果表明提取液的pH、离子强度、液固比及其二次项、交互项对大麦虫幼虫SOD的提取均有显著影响;响应面法（RSM）建立的大麦虫幼虫SOD比活性回归模型高度显著（p<0.0001）,可用于实际预测;优化条件为:pH7.43、离子强度0.26mol·L-1、液固比34.72:1,此时大麦虫幼虫SOD的比活性可达116.747 U·mg -1。经验证,实测值与预测值之间没有显著性差异,模型的准确性和有效性比较高。（2）本试验研究确定了大麦虫幼虫SOD纯化的最佳热击温度为65℃,硫酸铵分级沉淀最佳饱和度:第一步为50%,第二步为80%;大麦虫幼虫SOD经DEAE-Sepharose F.F.阴离子交换层析纯化,SOD活力峰为0.1mol·L-1NaCl洗脱段的第一个峰;经Sephadex G-75凝胶过滤层析纯化,从DEAE-Sepharose F.F.得到的SOD活力峰中分离出三个主要蛋白峰,SOD活力主要集中在第一个峰中。本试验分离纯化得到的大麦虫幼虫SOD活性较高,可达6815.66 U·mL-1,,比活性为7044.61U·mg-1,纯化倍数为68.54。纯化后的SOD经PAGE电泳鉴定达到电泳纯。（3）大麦虫幼虫SOD的热稳定性较好,其最适温度为40℃;在pH6～8之间比较稳定,其最适pH为6.0;大麦虫幼虫SOD对H2O2、β-巯基乙醇试剂十分敏感;SDS对大麦虫幼虫SOD的影响程度随着SDS含量的增加而加大;单独尿素对大麦虫幼虫SOD活性无太大影响,5mol·L-1（含0.5%的EDTA）尿素,即对酶活性完全抑制,说明金属辅基对酶活稳定起重要作用;大麦虫幼虫SOD受CHCl3-CH3CH2OH混合液的影响较小。（4）经鉴定,大麦虫幼虫SOD为Cu,Zn-SOD;其亚基分子量为21.55kDa,全酶分子量为42.76kDa;在278nm有紫外吸收峰。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 大麦虫概述
• 1.1.1 大麦虫的生活习性及营养价值
• 1.1.2 大麦虫的研究及应用现状
• 1.2 超氧化物歧化酶（SOD）概述
• 1.2.1 SOD 的催化机理
• 1.2.2 SOD 的种类与分布
• 1.2.3 SOD 的结构
• 1.2.4 SOD 的理化性质
• 1.2.5 SOD 的研究及应用现状
• 1.3 本研究的目的、意义及主要内容
• 1.3.1 本研究的目的和意义
• 1.3.2 研究内容
• 1.3.3 技术路线
• 第二章 大麦虫幼虫SOD 提取条件的研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 试验方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 单因素试验结果与分析
• 2.2.2 中心组合试验结果与分析
• 2.3 小结
• 第三章 大麦虫幼虫SOD 纯化技术研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 试验方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 热击法纯化大麦虫幼虫SOD
• 3.2.2 硫酸铵分级沉淀纯化大麦虫幼虫SOD
• 3.2.3 DEAE-Sepharose F.F.阴离子交换层析纯化大麦虫幼虫SOD
• 3.2.4 Sephadex G-75 凝胶过滤法纯化大麦虫幼虫SOD
• 3.2.5 大麦虫幼虫SOD 纯化结果
• 3.2.6 酶纯度的鉴定
• 3.3 小结
• 第四章 大麦虫幼虫SOD 性质研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 试验方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 大麦虫幼虫SOD 的稳定性
• 4.2.2 大麦虫幼虫SOD 的类型鉴定
• 4.2.3 大麦虫幼虫SOD 分子量测定
• 4.2.4 大麦虫幼虫SOD 的光谱性质
• 4.3 小结
• 第五章 结论与讨论
• 5.1 结论
• 5.2 讨论
• 5.3 创新点
• 5.4 展望
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介