球毛壳菌（Chaetomium globosum）功能基因克隆及表达研究

论文摘要

球毛壳菌（Chaetomium globosum）是一种应用前景广阔的植物病害生物防治菌。不仅能有效地防治多种蔬菜、林木和其它大田作物的病害,还能够降解木质素等难降解化合物,含有多种生产高价值酶类的基因,具有重要研究价值。本研究通过分子生物学技术克隆出球毛壳菌（C. globosum）中涉及生物防治、胁迫应答等方面共17个功能基因,通过生物信息学技术对这些基因进行分析,并对部分重要功能基因进行了表达和功能研究。利用简并引物PCR与RACE技术相结合的方法克隆了重要生物防治基因—内切几丁质酶基因（chi46）的完整DNA及全长cDNA序列,chi46基因DNA序列长1 466bp,cDNA编码区长度为1 350bp,编码449aa,编码蛋白的分子量为46.2kD,理论等电点为5.38。chi46基因DNA序列由2个外显子与1个内含子组成,外显子长度分别为528bp和822bp,内含子长度为73bp。内含子与外显子的剪接位点符合常规的GT/AG型剪接位点特征。BlastP相似性搜索结果表明chi46与粗糙脉孢菌（Neurospora crassa,XP323907）的几丁质酶相似性最高为85%。Signal P预测表明chi46氨基酸序列的N端31个氨基酸为信号肽,说明chi46为分泌型酶。用生物信息学技术从球毛壳菌EST数据库中获得了生物防治相关C4-甲基甾醇氧化酶（sterol）基因3′及5′端cDNA序列,用PCR方法克隆sterol基因的中间部分获得了全长基因。sterol基因cDNA序列（DQ532123）全长1 268bp,编码306个氨基酸残基组成的蛋白质,该蛋白的分子量为35.5kD,理论等电点为6.73。sterol基因DNA序列（DQ532124）全长1 151bp由4个外显子与3个内含子组成。内含子与外显子的剪接位点符合常规GT/AG剪接位点特征。从BlastP相似性搜索结果表明球毛壳菌（C. globosum）的sterol基因与粗糙脉孢菌（N. crassa,EAA33004）的sterol基因相似性最高为80%。在本实验室获得的球毛壳菌（C. globosum）ESTs序列基础上,利用RACE技术克隆了涉及球毛壳菌（C. globosum）胁迫应答、生物降解相关的小热激蛋白基因（hsp22.4,AY491980）、过氧化物膜蛋白基因（pero,AY555771）、二烯醇内酯水解酶基因（dlh,AY465528）全长cDNA序列;通过生物信息学技术（电子克隆技术）克隆了甘油醛-3-磷酸脱氢酶（gapdh,AY522719）、组蛋白H3（AY669068）,60S核糖体蛋白L10a（AY669070）等12条基因全长cDNA序列;同时克隆了hsp22.4、pero、dlh、gapdh基因的DNA序列;克隆获得的这些序列已经全部在GenBank上注册。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 课题研究的目的和意义
• 1.2 国内外研究进展
• 1.2.1 植物病害生物防治发展动态
• 1.2.2 生物防治菌球毛壳菌研究现状
• 1.2.3 本研究相关的部分功能基因研究进展
• 1.2.4 全长功能基因克隆方法简介
• 1.2.5 功能基因原核表达及酵母表达研究进展
• 1.3 目前生物防治菌球毛壳菌应用中存在的问题
• 1.4 课题来源及主要研究内容
• 1.4.1 课题来源
• 1.4.2 主要研究内容
• 第2章 实验材料与方法
• 2.1 球毛壳菌功能基因克隆及序列分析
• 2.1.1 菌丝总RNA、DNA提取及单链RACE模板合成
• 2.1.2 生物防治几丁质酶（chi46）基因的克隆
• 2.1.3 生物防治相关C4-甲基甾醇氧化酶基因（sterol）克隆
• 2.1.4 RACE技术克隆小热激蛋白（hsp22.4）等基因cDNA序列
• 2.1.5 甘油醛-3-磷酸脱氢酶（gapdh）等基因克隆及序列分析
• 2.1.6 生物信息学技术对基因序列综合分析
• 2.2 球毛壳菌功能基因原核表达及酵母表达
• 2.2.1 原核表达载体与菌株及主要试剂
• 2.2.2 几丁质酶基因（chi46）原核表达材料与方法
• 2.2.3 小热激蛋白基因（hsp22.4）原核表达材料与方法
• 2.2.4 过氧化物膜蛋白基因（pero）原核表达材料与方法
• 2.2.5 酵母表达载体与菌株
• 2.2.6 酵母表达主要试剂及培养基
• 2.2.7 表达载体pYE52-chi46、pYE52-hsp、pYE52-gapdh构建
• 2.2.8 重组表达载体酵母转化
• 2.2.9 酵母转化子的鉴定
• 2.2.10 转chi46 基因酵母几丁质酶特性分析方法
• 2.2.11 转hsp22.4、gapdh基因酵母逆境胁迫实验方法
• 第3章 球毛壳菌功能基因克隆及序列分析
• 3.1 菌丝体总RNA、DNA提取及RACE模板合成
• 3.1.1 球毛壳菌菌丝体高质量RNA提取
• 3.1.2 反转录合成单链3′RACE及5′RACE cDNA模板
• 3.1.3 球毛壳菌菌丝体高质量DNA提取
• 3.2 生物防治内切几丁质酶基因（chi46）的克隆
• 3.2.1 几丁质酶基因chi46 的获得及序列分析
• 3.2.2 几丁质酶基因chi46 保守区分析
• 3.2.3 几丁质酶基因chi46 信号肽与糖基化位点分析
• 3.2.4 几丁质酶基因chi46 多序列比对及三级结构预测
• 3.3 生物防治相关C4-甲基甾醇氧化酶基因（sterol）克隆
• 3.3.1 C4-甲基甾醇氧化酶基因（sterol）鉴定
• 3.3.2 C4-甲基甾醇氧化酶基因（sterol）获得
• 3.3.3 C4-甲基甾醇氧化酶基因（sterol）保守区分析
• 3.3.4 C4-甲基甾醇氧化酶基因（sterol）多序列比对
• 3.4 RACE技术克隆hsp22.4、pero、dlh基因
• 3.4.1 小热激蛋白基因（hsp22.4）克隆及序列分析
• 3.4.2 过氧化物膜蛋白基因（pero）克隆及序列分析
• 3.4.3 二烯醇内酯水解酶基因（dlh）克隆及序列分析
• 3.5 生物信息学方法克隆gapdh、组蛋白H3、Rp-L10a基因
• 3.5.1 甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因（gapdh）克隆及序列分析
• 3.5.2 组蛋白H3 基因的获得及序列分析
• 3.5.3 605核糖体蛋白L10a基因（Rp-L10a）
• 3.5.4 从球毛壳菌ESTs序列中筛选9 条功能基因
• 3.6 功能基因序列综合分析结果
• 3.6.1 内含子剪接位点分析结果
• 3.6.2 mRNA加尾信号分析结果
• 3.6.3 DNA碱基含量分析结果
• 3.7 关于球毛壳菌功能基因克隆及序列分析的讨论
• 3.7.1 毛壳菌孢子萌发慢的原因及改进措施
• 3.7.2 球毛壳菌总RNA提取方法优化
• 3.7.3 球毛壳菌基因组DNA提取方法改良
• 3.7.4 RACE模板合成应该注意的问题
• 3.7.5 RACE-PCR方法克隆基因要点
• 3.7.6 几丁质酶基因（chi46）克隆中遇到的问题及解决措施
• 3.7.7 克隆的功能基因生物信息学分析
• 3.8 本章小结
• 第4章 球毛壳菌功能基因原核及酵母表达研究
• 4.1 生物防治几丁质酶基因（chi46）原核表达研究
• 4.1.1 原核表达载体pGEX-chi46 的构建
• 4.1.2 原核表达质粒pGEX-chi46 在大肠杆菌中的表达
• 4.2 小热激蛋白基因（hsp22.4）原核表达研究
• 4.2.1 原核表达载体pGEX-hsp的构建
• 4.2.2 原核表达质粒pGEX-hsp在大肠杆菌中的表达
• 4.3 过氧化物膜蛋白基因（pero）原核表达研究
• 4.3.1 原核表达载体pET28a-pero的构建
• 4.3.2 原核表达质粒pET28a-pero在大肠杆菌中的表达
• 4.4 酿酒酵母生长曲线
• 4.5 生物防治几丁质酶基因（chi46）酵母表达
• 4.5.1 重组pYE52-chi46 酵母表达载体构建
• 4.5.2 几丁质酶chi46 基因酵母表达转录水平检测
• 4.5.3 转chi46 基因酵母几丁质酶特性分析
• 4.6 小热激蛋白基因（hsp22.4）酵母表达研究
• 4.6.1 重组pYE52-hsp酵母表达载体双酶切检测
• 4.6.2 hsp22.4 基因酵母表达转录水平检测
• 4.6.3 转hsp22.4 基因酵母抗逆实验
• 4.7 甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因（gapdh）酵母表达
• 4.7.1 重组pYE52-gapdh酵母表达载体构建
• 4.7.2 gapdh酵母表达转录水平检测
• 4.7.3 转gapdh基因酵母Na2C03和高温胁迫实验
• 4.8 关于球毛壳菌功能基因原核表达及酵母表达的讨论
• 4.8.1 原核表达诱导过程中出现的问题及解决办法
• 4.8.2 几丁质酶chi46 基因原核表达特性
• 4.8.3 在大肠杆菌中表达重组蛋白存在的问题
• 4.8.4 酵母表达引物设计中应该注意的问题
• 4.8.5 酵母转化子菌落PCR检测方法优化
• 4.8.6 酵母总RNA提取方法改进
• 4.8.7 环境条件对chi46 基因转化子酶活的影响
• 4.8.8 转基因酵母逆境胁迫实验中碳源的选择原则
• 4.8.9 转hsp22.4 及gapdh基因酵母抗逆性比较
• 4.9 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 哈尔滨工业大学博士学位论文原创性声明
• 哈尔滨工业大学博士学位论文使用授权书
• 哈尔滨工业大学博士学位涉密论文管理
• 致谢
• 个人简历