Axin基因和APC基因片段对结肠癌细胞SW480生物学行为的影响及其机制研究

论文摘要

背景：结直肠癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,在西方国家,其发病率和死亡率均居第二位。近年来的研究发现,90%以上的结直肠癌存在Wnt经典信号转导通路的激活,该通路异常激活的标志是β-catenin的稳定和细胞核内的积聚。在结直肠癌细胞中,APC基因的突变为wnt通路激活最常见的原因。APC基因体细胞突变多发生在密码子1250至1500间,产生截短蛋白,常丧失Axin的结合位点,进而不能有效的降解β-catenin。另一方面,有实验表明,与APC结合的Axin比Axin自身更能有效地诱导β-catenin的降解。APC和Axin的相互作用在肿瘤的发生中发挥着重要作用。有研究显示,将外源性的野生型APC基因导入APC突变的结直肠癌细胞,可导致β-catenin的降解,下调β-catenin的水平。此外,将野生型Axin基因导入APC或Axin突变的结直肠癌细胞亦可导致β-catenin降解及肿瘤细胞凋亡。野生型APC和Axin基因单独导入结直肠癌细胞已经被证实能够下调β-catenin水平及促进肿瘤细胞凋亡,而将两者共同导入体内有望取得更强的抑瘤效果但还有待更多的研究证实。由于APC基因全长大于10kb,直接用于基因治疗的操作性较困难。本课题组在前期实验中根据APC的功能结构域扩增出5条功能片段并构建了5个重组质粒,结果证实携带APC5（aa1020-1698）基因片段的重组质粒pEGFP-N3/APC5最能有效降低β-catenin表达且基因片段较小。目的：建立稳定表达APC5的结肠癌细胞株,验证APC5基因片段是否具有负性调控wnt信号途径及抑制肿瘤细胞生长的功能,,通过研究Axin基因共转APC5稳定细胞株产生的生物学效应,明确APC5基因片段与Axin基因共同作用在体外抑瘤方面是否优于APC5单独作用,为结直肠癌的联合基因治疗提供实验依据。方法：（1）对携带野生型Axin基因的重组质粒pCS2-MT/Axin和携带APC5基因片段的重组质粒进行转化、提取、双酶切及测序鉴定。（2）将重组质粒pEGFP-N3/APC5用脂质体介导法转染入人结肠癌细胞系SW480,经过G418筛选,多次采用有限稀释法连续克隆化,获得表达目的基因APC5的稳定细胞株。通过观察细胞克隆中绿色荧光蛋白的表达及Western blot法检测阳性克隆中标签蛋白GFP的表达,明确重组质粒转染后能否在肿瘤细胞中正确表达从而发挥作用。（3）用MTT法计算稳定细胞株的生长抑制率、RT-PCR法检测重组质粒pEGFP-N3/APC5对wnt信号通路的关键分子β-catenin及下游靶基因c-myc、survivin和cyclinDl mRNA表达水平的影响,证实APC5片段是否具有负性调控wnt通路及抑制肿瘤细胞生长的功能。（4）将Axin基因共转染表达APC5的稳定细胞株,通过MTT法计算细胞生长抑制率、RT-PCR检测wnt通路相关基因mRNA的表达,设表达APC5的稳定细胞株作对照。Western blot法检测wnt通路相关基因蛋白的表达、流式细胞术检测细胞周期,设APC5单转组、转染空载体组及未转染SW480细胞为对照。使用统计学软件SPSS13.0对数据进行统计学分析。结果：（1）pCS2-MT/Axin经NcoI和XhoI双酶切,琼脂糖凝胶电泳可见一大小约2.5kb的目的片段和4.3kb的载体片段；重组质粒pEGFP-N3/APC5经BamHI和XhoI双酶切,琼脂糖凝胶电泳可见一条大小约2.0kb的目的片段和一条4.7kb的载体片段,片段大小与预期相符,测序结果正确无误。（2）pEGFP-N3/APC5转染细胞在选择培养基中长出多个耐药克隆,所有克隆在荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白表达。western blot法在所有克隆中检测到标签蛋白的表达。（3）MTT结果显示：空载体转染组和空白对照组的抑制率分别为2.9%和0.0%,两组稳定细胞株SW480/Axin的生长抑制率较大,分别为41.3%和35%,后两组与前面两组比较,差异非常显著（P<0.01）；Axin共转染稳定细胞株SW480/APC5后,同空载体pCS2-MT共转SW480/APC5组（抑制率4.9%）及SW480/APC5组（抑制率0.0%）相比,两组SW480/APC5-Axin共转细胞的生长抑制率较大（分别为31.4%,41.7%）,差异有显著性（P<0.05）。（4）RT-PCR结果：在各组细胞中,琼脂糖凝胶电泳显示,分别在约330bp、310bp、300bp、340bp处可见清晰的单一条带,与目的基因β-catenin、c-myc、survivin和cyclinDl的分子量大小相符。对目的条带与内参条带的灰度比值行单因素方差分析,组间比较采用t检验。结果显示：空白SW480细胞和仅转染空载体pEGFP-N3的SW480细胞之间、两组SW480/APC5细胞之间RT-PCR电泳条带灰度比值间的差异无显著性（p>0.05）,而后两组条带的灰度比值同前相比,比值较小,差异有显著性（p<0.05）。Axin共转染稳定细胞株SW480/APC5后,与SW480/APC5-vector组及SW480/APC5组相比,两组SW480/APC5-Axin细胞的电泳条带灰度比值较小,差异有显著性（p<0.05）（5）Western blot结果：在各组细胞中,均检测到特异条带,与目的基因的分子量大小相符。对Western blot电泳条带的灰度比值进行单因素方差分析,组间比较采用t检验,结果显示：空白SW480细胞组和SW480/vector-vector组电泳条带灰度比值之间的差异无显著性（p>0.05）；SW480/APC5组电泳条带灰度比值较小,同前两组比较,差异有显著性（P<0.05）;SW480/APC5-Axin组电泳条带灰度值最小,同前面三组的任意一组比较,差异均有统计学意义（p<0.05）。（6）流式细胞仪细胞周期分析显示：分别转染空载体、APC5、APC5-Axin的细胞中,后2种方式的转染均能引起细胞不同程度滞留于G1／S期。与APC5单基因转染组相比,共转染基因组G1／S期比例最大,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论：成功建立了稳定表达APC5基因片段的人结肠癌细胞株SW480。APC5基因片段和Axin基因共同作用能够下调人结肠癌细胞SW480中wnt通路相关基因β-catenu、c-myc、survivin和cyclinDl的表达、抑制SW480细胞增殖和诱导细胞周期阻滞于G1／S期,其效果优于APC5单独作用,为结直肠癌的联合基因治疗提供了实验依据。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词
• 前言
• 第一章 pEGFP-N3/APC5和pCS2-MT/Axin真核表达载体的提取和鉴定
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 结论
• 第二章 APC基因片段稳定转染SW480细胞株的建立及其功能的初步研究
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 结论
• 第三章 Axin基因转染APC5稳定表达细胞株WS480的生物学效应及其机制探材料与方法
• 1 实验材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 结论
• 参考文献
• 综述
• 致谢
• 攻读博士学位期间发表的论文