JSRV表面蛋白抗原表位的筛选及检测试剂盒的制备

论文摘要

研究背景:绵羊肺腺癌（ovine pulmonary adenocarcinoma, OPA）是由β-反转录病毒属绵羊肺腺瘤病病毒（jaagsiekte sheep retrovirus, JSRV）引起的一种传染性肺脏肿瘤性疾病,世界动物卫生组织将其列为B类传染病。目前国内对该病的诊断主要依靠常规病理学方法检测,严重障碍了我国对OPA的防控。主要目的:建立快速特异的实验室及适用于基层的诊断方法,为临床及基层检测诊断提供技术支持,为进一步分析表面蛋白（ surface protein,SU）蛋白的功能、疫苗设计及对JSRV的生物学特性研究提供素材。研究方法:以获得的三株抗JSRV-SU蛋白的单克隆细胞分泌的McAb为一抗,应用噬菌体展示结合肽探针扫描技术,鉴定三株单抗所识别的线性表位;并应用非竞争性ELISA法测定三株单抗的功能性亲和常数;以阳性标准病料与健康阴性羊肺组织为样本,以纯化的多抗和单克隆抗体为基本检测试剂,建立双抗体夹心ELISA检测方法;针对外源性JSRV U3区设计特异性引物,建立JSRV的环介导等温扩增（Loop-mediatedisothennalamplification ,LAMP）检测方法,并以700ng健康羊基因组DNA为背景进行敏感性和特异性试验;通过基因克隆技术对JSRVenv及绵羊ras基因进行序列测定;运用基因重组方法构建JSRVenv重组真核表达质粒,并通过脂质体转染建立稳定表达细胞系。研究结果:1.三株单抗3B3、3D6、1D6的亲和常数分别为5.06×109L/mol﹑5.82×109 L/mol﹑ 2.91×109 L/mol ;且其所对应的抗原表位分别为W156APEGTPD163,F71SYQSQHPHCI81,D98EKTGKR104;2.首次基于JSRV-SU蛋白的单抗建立了夹心ELISA法,并建立了阴性与阳性的判定标准（当P/N≥2.21时判为阳性;当P/N<1.85时判为阴性;当2.21>P/N≥1.85时判为可疑）;3.在国内首次基于内外源性病毒长末端重复序列（ long terminal repeat ,LTR）的差异建立了LAMP诊断方法,所建立的反应体系在恒温水浴锅中作用60min即可得到其特有的阶梯状条带,而且对内源性JSRV的扩增结果为阴性,该方法对JSRV前病毒DNA的最小检测限为10拷贝,灵敏性高于一步PCR方法。LAMP和特异性PCR及套式PCR方法检测临床样品的符合率分别为92 %和100%;4.通过基因克隆技术对JSRVenv及绵羊ras基因进行序列测定,结果发现,本研究克隆的pMD-exJSRVenv1属于Ⅱ型exJSRV;而pMD-exJSRVenv2属于Ⅰ型exJSRV;在exJSRV氨基酸序列中存在“YXXM”基序;绵羊ras基因与已知其他物种的该段基因作比对差异率较小,基本保守,且与牛的ras基因同源性最高;5.成功构建了含有env及tm基因的重组真核表达质粒pcDNA3.1-env及pcDNA3.1-TM-HA,并建立了稳定表达JSRV囊膜蛋白（Env）及其TM亚基的HepG2细胞系。结论:本研究建立了特异性检测JSRV的夹心ELISA法和LAMP法,对于我国养羊业的健康发展,具有重要的实用价值,对研究OPA防制措施等均有重要意义。另外,JSRV env基因的克隆和表达及对绵羊ras基因的序列分析,对于丰富JSRV的分子发病机理以及为进一步研究该蛋白与JSRV诱导OPA发病关系搭建了重要的实验平台。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 绵羊肺腺癌概述
• 1.1.1 绵羊肺腺癌的临床及病理学特征
• 1.1.2 绵羊肺腺癌流行病学
• 1.1.3 绵羊肺腺癌的病原学
• 1.1.4 OPA 的发病机理
• 1.1.5 OPA 防控展望
• 1.1.6 OPA 作为人肺癌研究的动物模型
• 1.2 抗原表位的研究
• 1.2.1 蛋白质结构预测技术
• 1.2.2 肽探针扫描技术（Pepscan 技术）
• 1.2.3 噬菌体展示技术
• 1.2.4 生物传感器技术筛选表位
• 1.2.5 利用抗原抗体反应方法筛选表位
• 1.3 环介导的等温扩增技术
• 1.3.1 LAMP 技术原理
• 1.3.2 LAMP 技术优点
• 1.4 研究的目的及意义
• 2 实验一 JSRV 囊膜基因表面蛋白单克隆抗体的制备及鉴定
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 试剂与药品
• 2.1.3 主要仪器
• 2.1.4 杂交瘤细胞的复苏
• 2.1.5 杂交瘤细胞分泌稳定性检测
• 2.1.6 抗体亚类的测定
• 2.1.7 单克隆抗体的特异性检测
• 2.1.8 单克隆抗体的制备及纯化
• 2.1.9 单克隆抗体效价的测定
• 2.1.10 JSRV-SU 蛋白抗原表位的初步定位
• 2.1.11 单克隆抗体功能性亲和常数的测定
• 2.2 结果
• 2.2.1 杂交瘤细胞分泌稳定性检测
• 2.2.2 单克隆抗体亚型的鉴定
• 2.2.3 单克隆抗体的特异性检测
• 2.2.4 单克隆抗体纯化后鉴定
• 2.2.5 单克隆抗体效价的测定
• 2.2.6 JSRV-SU 蛋白抗体抗原表位的初步定位
• 2.2.7 三株单抗的抗原抗体结合反应曲线及抗体亲和常数的推导
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 3 实验二 噬菌体展示结合肽扫描技术筛选 JSRV-SU 抗原表位
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 菌株、表达载体和质粒
• 3.1.2 试剂与药品
• 3.1.3 主要仪器
• 3.1.4 主要溶液的配置
• 3.1.5 方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 利用噬菌体展示随机12 肽库进行模拟抗原表位筛选
• 3.2.2 运用肽扫描技术筛选抗原表位
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 4 实验三 绵羊肺腺瘤病夹心 ELISA 诊断方法的初步建立
• 4.1 材料
• 4.1.1 样品的来源及处理
• 4.1.2 主要试剂及质粒、抗体
• 4.1.3 主要仪器与耗材
• 4.2 方法
• 4.2.1 重组 JSRV-SU 蛋白的大量表达与纯化
• 4.2.2 兔抗 JSRV-SU 多抗的制备及纯化
• 4.2.3 夹心 ELISA 检测方法的建立
• 4.3 结果
• 4.3.1 重组 JSRV-SU 蛋白的大量表达与纯化
• 4.3.2 兔抗 JSRV-SU 多抗的制备及提纯
• 4.3.3 夹心 ELISA 检测方法的建立
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 5 实验四 绵羊肺腺瘤病 LAMP 快速诊断方法的建立
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 样品的来源及处理
• 5.1.2 常用试剂
• 5.1.3 引物设计
• 5.1.4 基因组 DNA 的提取
• 5.1.5 LAMP 诊断方法的优化及建立
• 5.1.6 临床样品的检测
• 5.2 结果
• 5.2.1 标准 LTR 序列的扩增
• 5.2.2 标准 LTR 的序列测定
• 5.2.3 LAMP 检测方法的优化
• 5.2.4 反应产物内切酶鉴定
• 5.2.5 重复性试验
• 5.2.6 特异性及敏感性测定
• 5.2.7 临床样品的检测
• 5.3 讨论
• 5.4 小结
• 6 实验五 内外源性 JSRV env 基因的克隆及其序列分析
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 样品的来源及处理
• 6.1.2 常用试剂
• 6.1.3 引物设计与合成
• 6.1.4 基因组 DNA 的提取
• 6.1.5 内外源性 JSRV env 基因的 PCR 扩增
• 6.1.6 目的片段的克隆及序列分析
• 6.2 结果
• 6.2.1 绵羊肺腺瘤病自然病例肺肿瘤组织基因组 DNA 的提取
• 6.2.2 目的基因 PCR 扩增结果
• 6.2.3 序列分析
• 6.3 讨论
• 6.4 小结
• 7 实验六 表达绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白及其 TM 亚基细胞系的建立
• 7.1 材料与方法
• 7.1.1 主要材料
• 7.1.2 主要试剂和工具酶
• 7.1.3 引物设计与合成
• 7.1.4 目的基因的扩增
• 7.1.5 重组表达载体的构建及鉴定
• 7.1.6 细胞转染
• 7.1.7 Western blot 方法检测
• 7.1.8 间接免疫荧光检测
• 7.2 结果
• 7.2.1 PCR 扩增目的基因结果
• 7.2.2 重组表达质粒的构建
• 7.2.3 稳定表达 JSRV Env 及 TM-HA 细胞系的建立
• 7.3 讨论
• 7.4 小结
• 8 实验七 绵羊ras 基因第一、二外显子的扩增及序列测定
• 8.1 材料与方法
• 8.1.1 样品的来源及处理
• 8.1.2 常用试剂
• 8.1.3 主要仪器
• 8.1.4 引物设计与合成
• 8.1.5 基因组 DNA 的提取
• 8.1.6 ras 基因的 PCR 扩增
• 8.1.7 目的片段的克隆及序列分析
• 8.2 结果
• 8.2.1 绵羊肺腺瘤病自然病例肺肿瘤组织基因组 DNA 的提取
• 8.2.2 目的基因 PCR 扩增结果
• 8.2.3 序列分析
• 8.3 讨论
• 8.4 小结
• 9 总体结论
• 10 创新点及研究展望
• 10.1 创新点
• 10.2 不足之处
• 10.3 研究展望
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介