论文摘要
阿片依赖是一种慢性复发性脑病,以神经生理功能紊乱及病态行为如强制性的药物使用及持久的心理渴求为特征。目前阿片依赖发生的详细机制尚未阐明。但大量研究表明,机体长期接触阿片类物质产生的神经元适应性改变是阿片依赖发生的生物学基础。这些代偿性适应不仅发生在阿片受体作用系统本身,还涉及到许多非阿片受体作用系统,如兴奋性氨基酸受体系统、多巴胺受体系统、乙酰胆碱受体系统、咪唑啉受体系统等。磷脂酰乙醇胺结合蛋白（phosphatidylethanolamine binding protein,PEBP）是本课题组在前期蛋白质组学研究中发现的吗啡依赖大鼠脑区差异表达蛋白。该蛋白不仅是海马胆碱能神经刺激肽（hippocampal cholinergic neurostimulating peptide,HCNP）的前体蛋白,还具有与疏水性配体（如膜磷脂、阿片受体、核苷酸等）结合,参与不同信号转导途径（Raf-1/MEK/ERK、G蛋白偶联受体）等多种功能。因此,本研究目的为观察该蛋白是否在阿片依赖过程中发挥作用并探讨其可能机制。我们首先建立大鼠吗啡依赖模型,以确证PEBP在吗啡依赖大鼠不同脑区的差异表达。蛋白免疫印迹实验结果显示,相对于生理盐水组,该蛋白表达量在吗啡依赖大鼠的海马、伏隔核有显著性上调（分别为1.6倍、1.22倍,P < 0.01,与生理盐水组相比）,在内侧前额叶皮层有显著性下调（0.65倍,P < 0.05,与生理盐水组相比）;而在纹状体、小脑与脑干等脑区无统计学显著性改变。该实验结果与蛋白质组结果（海马、前额皮层、纹状体均有上调）并不完全一致,但提示PEBP蛋白表达量在吗啡依赖大鼠具有脑区差异表达。蛋白质组与蛋白免疫印迹实验结果均显示PEBP蛋白表达在吗啡依赖大鼠海马区具有显著上调。海马是哺乳动物脑边缘系统的主要组成部分,可接受多途径的传入信息,与吗啡精神依赖与躯体依赖过程均密切相关。为了进一步研究PEBP在吗啡依赖病理过程的调节,我们建立了吗啡依赖与自然戒断大鼠模型,观察大鼠海马区PEBP蛋白表达在不同时程的变化。PEBP蛋白C端抗体（针对152-164位氨基酸）免疫印迹实验结果显示PEBP具有随时程逐渐变化的趋势:与盐水对照组大鼠相比,在吗啡依赖4 d、8 d海马PEBP表达量均有显著性上调（分别为2倍与2.7倍,P < 0.01,与生理盐水组相比）;而自然戒断3 d PEBP蛋白下调至正常水平,在自然戒断7 d、14 d蛋白表达量再次显著上调且逐渐增加（分别为2倍与2.4倍,P < 0.05,与生理盐水组相比）,至21 d天蛋白表达量下降,但与对照组相比仍有显著性增加（1.8倍,P < 0.05,与生理盐水组相比）;该上调趋势持续至自然戒断28 d。在上述吗啡依赖与自然戒断模型中采用戒断症状评分法观察30 min内各组大鼠的躯体戒断症状以及体重变化。结果发现,在自然戒断前9 d,自然戒断大鼠症状评分均显著高于生理盐水对照组大鼠;其中自然戒断第2、3 d分数较高,然后逐渐降低。自然戒断大鼠体重在戒断第1 d开始下降,至第2 d降至最低点,第3 d开始回升,第6 d恢复至戒断前体重水平。生理盐水对照组大鼠体重在相同时程则持续增加。该部分结果提示,大鼠体重与戒断症状有一定的相关性;PEBP表达量在自然戒断症状较重时下调至最低,随着大鼠自然戒断症状逐渐减轻而逐渐上调,呈一定负相关性。为了进一步确定PEBP与阿片躯体依赖病理过程的关系,我们采用反义核酸干涉技术研究下调PEBP后对吗啡躯体依赖戒断症状表达的影响。首先应用Sfold、Mfold以及RNAstructure等软件设计七条针对PEBP编码序列（coding sequence,CDS）的反义寡核苷酸（antisense oligodeoxynuclecotide,ASODN）;然后以PC12细胞做为筛选模型,根据RT-PCR与蛋白免疫印迹实验确定具有生物学活性的ASODN（能下调PEBP基因与蛋白表达量）。得到有生物学活性的ASODN后,通过在大鼠海马区连续微量注射PEBP-ASODN来观察PEBP蛋白表达量下调对吗啡依赖大鼠催促戒断行为的影响。行为学实验结果显示,与吗啡依赖组大鼠相比,PEBP-ASODN微量注射的慢性吗啡处理组大鼠戒断症状评分显著增加（13.67分,P < 0.05,与吗啡处理组相比）,其中某些症状显著加重（湿狗样抖动,激惹、流涎等）;而PEBP-正义寡核苷酸（sense oligodeoxynuclecotide,SODN）微量注射对慢性吗啡处理大鼠的戒断症状表达并无显著影响（9.67分,P>0.05,与吗啡处理组相比）。实验结果提示,PEBP确实参与了阿片依赖病理过程,海马区PEBP蛋白表达量下调可促进吗啡躯体依赖大鼠某些戒断症状显著加重。由PEBP蛋白氨基端第2-12位氨基酸解离下的海马胆碱能神经刺激肽（HCNP）在中枢胆碱能系统的神经发育中具有重要作用,可通过促进胆碱乙酰转移酶活性增强中枢海马胆碱能系统功能。而有研究显示,海马胆碱能系统与阿片躯体依赖也密切相关。因此,我们在上述实验结果的基础上,继续在大鼠吗啡依赖与自然戒断模型中观察中枢海马胆碱能系统活性的变化,研究PEBP是否通过该系统参与吗啡躯体依赖过程。分别采用PEBP C端抗体（针对PEBP 152-164位氨基酸）与N端抗体（针对PEBP 2-12位氨基酸）进行蛋白免疫印迹实验,间接推测吗啡依赖与自然戒断不同时程大鼠海马区HCNP的表达量变化。实验结果显示,大鼠海马HCNP表达量在吗啡依赖与自然戒断不同时程具有与PEBP相同的变化趋势。采用紫外分光光度法测定大鼠海马区胆碱乙酰转移酶（choline acetyl transferase,ChAT）活性的变化。实验结果显示,与生理盐水对照组相比,吗啡处理组大鼠第4 d ChAT活性即显著增高（138 nmol/h.mg pro,生理盐水对照组为118 nmol/h.mg pro,P < 0.01）;第8 d吗啡处理组与催促戒断组大鼠ChAT活性均有显著升高（分别为149 nmol/h.mg pro与147 nmol/h.mg pro,生理盐水对照组为126 nmol/h.mg pro,P < 0.05）;而在自然戒断3 d自然戒断大鼠ChAT活性下降至生理盐水对照组水平（分别为97 nmol/h.mg pro与101 nmol/h.mg pro,P > 0.05）;随后自然戒断组大鼠ChAT活性再次逐渐增高,在自然戒断第14d显著高于生理盐水对照组水平（150 nmol/h.mg pro与115 nmol/h.mg pro,P < 0.01）);该增高趋势持续至自然戒断第21 d,ChAT活性恢复至正常水平。该实验结果提示,吗啡依赖与自然戒断不同时程大鼠海马区HCNP含量、CHAT活性与PEBP表达呈现较为一致的变化趋势,提示PEBP可能通过海马胆碱能系统参与阿片躯体依赖过程。综上所述,本研究在国内外首次发现PEBP在吗啡依赖与自然戒断病理过程中具有脑区与时程特异性的差异表达,大鼠海马区PEBP表达量下调可促进纳络酮催促戒断症状的发生,PEBP可能通过调节海马胆碱能系统功能参与阿片躯体依赖过程。
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