除虫菊CPS基因的克隆及其转化烟草的研究

论文摘要

除虫菊（Chrysanthemum cinerariaefolium）是一种菊科多年生草本植物,为天然杀虫剂除虫菊酯的原料作物。除虫菊的杀虫活性物质除虫菊酯（Pyrethrins）具有高效、广谱、低毒、无污染等特点。随着人们健康和环保意识的增强,许多发达国家高度重视除虫菊的开发利用,市场需求不断增长。但是除虫菊酯在天然除虫菊中的含量较低,为满足日益增长的市场需求,开展除虫菊酯生物合成途径及其调控研究具有十分重要的意义。菊酰焦磷酸合成酶（Chrysanthemyl diphosphate synthase,CPS）是除虫菊酯生物合成途径中一个重要酶,它催化除虫菊酯中环丙烷结构的形成。本研究以“云除一号”除虫菊的花蕾为材料,提取RNA并进行RT-PCR扩增,克隆了除虫菊的菊酰焦磷酸合成酶基因;构建了菊酰焦磷酸合成酶基因植物表达载体,并将其转入根癌农杆菌GV3101中,然后通过农杆菌介导法将CPS基因导入烟草,并初步探讨了CPS基因在烟草中的表达,为今后在除虫菊中的应用提供依据。主要研究结果如下:①提取除虫菊花蕾的RNA,反转录合成cDNA,并扩增出CPS基因。CPS基因全长1188 bp,编码395个氨基酸。通过生物信息学分析表明,此CPS蛋白能定位于叶绿体,具有质体转运肽,还具有异戊烯基转移酶家族成员所特有的2个天冬氨酸富集基序。②将扩增的CPS基因,通过平末端连接的方式,构建到载体pDH51中,经酶切和PCR鉴定表明,已成功构建了中间克隆载体pDH-CPSs和pDH-CPSas。③用限制性内切酶从中间载体上切下两端分别含有CaMV35S启动子和35S终止子的CPS嵌合基因35SP-CPSs-35ST和35SP-CPSas-35ST的片段,将其插入到植物表达载体pCAMBIA1301的多克隆位点上,从而构建成带有GUS报告基因的正义和反义植物表达载体pCAMBIA-CPSs和pCAMBIA-CPSas。④采用冻融法,将重组质粒pCAMBIA-CPSs和pCAMBIA-CPSas导入农杆菌GV3101中,在含有卡那霉素（Kan）的平板上筛选阳性克隆,并进行菌落PCR和提取质粒、PCR扩增检测,结果表明重组质粒已成功导入农杆菌GV3101中。⑤采用叶盘转化法,以构建的工程菌对烟草进行遗传转化。在Kan 50mg/L的筛选压下,取正常生根的烟草植株进行PCR检测,并对检测呈阳性的植株进行GUS活性检测,证实目的基因已整合到烟草基因组中。取转pCAMBIA-CPSs质粒的植株叶片,提取总RNA,然后进行RT-PCR,结果表明CPS基因在烟草叶片中转录正常。⑥采用分光光度计法测定转基因烟草叶片中叶绿素和类胡萝卜素的含量,结果表明在烟草中异源超表达除虫菊CPS基因,会导致烟草类胡萝卜素含量显著降低,而反义表达CPS基因对烟草类胡萝卜素含量影响不大,CPS基因对叶绿素的含量并没有造成影响。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词表
• 1 绪论
• 1.1 除虫菊酯概述
• 1.2 植物萜类物质的代谢研究
• 1.2.1 植物萜类物质的简介
• 1.2.2 萜类物质的代谢研究
• 1.3 除虫菊酯的生物合成
• 1.3.1 除虫菊酯的化学结构
• 1.3.2 除虫菊酯的生物合成途径
• 1.3.3 除虫菊酯生物合成途径的相关酶
• 1.4 研究目的和意义
• 1.5 研究内容和技术路线
• 1.5.1 研究内容
• 1.5.2 技术路线
• 2 除虫菊 CPS 基因的克隆及表达载体的构建
• 2.1 材料与仪器
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 植物材料
• 2.1.3 酶与化学试剂
• 2.1.4 引物
• 2.1.5 常用抗生素贮存液
• 2.1.6 培养基及缓冲液
• 2.1.7 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 质粒DNA 的提取
• 2.2.2 DNA 的纯化
• 2.2.3 大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
• 2.2.4 除虫菊花总RNA 的提取
• 2.2.5 目的基因的RT-PCR 扩增
• 2.2.6 目的DNA 片段的回收
• 2.2.7 CPS 基因的克隆与鉴定
• 2.2.8 CPS 基因的生物信息学分析
• 2.2.9 CPS 基因植物表达载体的构建
• 2.2.10 重组质粒转化农杆菌
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 除虫菊花的总RNA 的质量鉴定
• 2.3.2 除虫菊CPS 基因的RT-PCR 扩增
• 2.3.3 CPS 基因的克隆及鉴定
• 2.3.4 CPS 基因的测序与生物信息学分析
• 2.3.5 表达载体的构建及鉴定
• 2.3.6 根癌农杆菌的转化及鉴定
• 3 CPS 基因转化烟草的研究
• 3.1 材料与仪器
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 工程菌株
• 3.1.3 酶与化学试剂
• 3.1.4 引物
• 3.1.5 培养基及缓冲液
• 3.1.6 实验仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 外植体和农杆菌的准备
• 3.2.2 烟草的侵染
• 3.2.3 转基因烟草的筛选培养和移栽
• 3.2.4 转基因植株的PCR 检测
• 3.2.5 转基因烟草的GUS 染色检测
• 3.2.6 转基因烟草的RT-PCR 检测
• 3.2.7 转基因烟草的生理生化分析
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 叶盘法转化烟草
• 3.3.2 转基因植株的PCR 鉴定
• 3.3.3 GUS 染色检测
• 3.3.4 RT-PCR 半定量检测
• 3.3.5 转基因烟草的生理生化分析
• 4 讨论
• 4.1 CPS 基因的克隆和分析
• 4.2 CPS 基因表达载体的构建策略
• 4.3 CPS 基因对烟草生理生化的影响
• 5 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 后续工作展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录