论文题目: 苜蓿中华根瘤菌耐盐分子机制的研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 微生物学
作者: 魏巍
导师: 杨苏声
关键词: 苜蓿中华根瘤菌,突变,耐盐,功能互补
文献来源: 中国农业大学
发表年度: 2005
论文摘要: 苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)042BM分离自新疆的和田苜蓿,能够在含0.6mol/LNaCl的FY基本培养基中生长。通过构建Tn5-1063插入突变体库,从20,000多株突变株中得到8株盐敏感突变株W2、W4、W8、W10、W11、W15、W19和E4。耐盐性试验表明,它们都不能在含有0.4mol/L NaCl的FY培养基中生长,在0.3mol/L LiCl的FY培养基中不能生长;其中,W15在含有0.1mol/L LiCl的FY培养基上不能生长;W8,W10在含有0.2mol/L LiCl的FY培养基上不能生长。除W4外,其余突变株在相同渗透压下,对葡萄糖所造成的渗透压不敏感,只对盐造成的渗透压敏感,进一步证明它们是盐敏感而非渗透压敏感,同时对温度和pH的耐受性没有改变。 以转座子内的基因luxAB为探针进行Southern杂交,发现Tn5在这8个突变株中都只有单一拷贝的插入,表明突变株的盐敏感表型是由于转座子插入诱变造成的。对Tn5插入位点侧翼序列进行克隆、测序,得到7个与耐盐有关基因,在Genbank的登录号为AY502026-AY502032。经分析,在W2中,Tn5插入在染色体基因greA中,此基因编码细菌转录切割因子;在W4中,Tn5插入在基因omp10内部,该基因编码细菌外膜蛋白:在W11中,Tn5插入在基因relA内部,该基因编码鸟苷五磷酸合成酶;在W15中,Tn5插入在基因nuoL内部,此基因编码NADH呼吸链L亚基蛋白;在W19中,Tn5插入在编码核酸酶、解旋酶基因的内部,该基因与DNA的复制和修复有关;在W8和W10中,Tn5插入在基因SMc02759内部,该基因功能未知:在E4中,Tn5插入在基因SMc00709内部,基因功能未知。 根据W2测序结果,PCR扩增得到包含greA基因启动子的全长区段,将其克隆至穿梭载体pBBR1MCS-5上,三亲本杂交将完整的greA基因转入突变株W2中,使突变株恢复耐盐性,证明greA基因是一种与耐盐有关的转录切割因子基因。 根据W11测序结果,PCR克隆了relA基因ORF,克隆到表达载体pET—28a,并转入E.coli的relA突变株中,实验表明,该基因有效地恢复了E.coli的relA突变株在选择性培养基上的生长,而空载体的对照则无法生长,从而有力地证明了relA基因的功能。同时,结瘤实验表明,relA基因的突变导致了042BM的结瘤缺陷。PCR扩增得到包含启动子的relA基因全长,将其克隆至穿梭载体pBBR1MCS-5上。三亲本杂交将完整的relA基因转入突变株W11中,使突变株恢复耐盐性,进一步表明relA基因是一种重要的与耐盐有关的基因。 根据实验结果,我们认为,S.meliloti 042BM的耐盐性涉及到:1)全细胞调控水平;2)大分子(如DNA)代谢水平;3)某些与抗逆有关的特殊物质的合成;4)能量代谢及离子转运系统;5)维持细胞整体结构的水平,反映出多基因的网络调控机制。
论文目录:
摘要
Abstract
Abbreviation
第一章 绪论
1.1 本论文研究的理论和应用意义
1.2 根瘤菌分子遗传学的研究进展
1.3 细菌耐盐机制的研究进展
1.4 转座子标签技术
1.5 本论文的研究路线与目标
第二章 苜蓿中华根瘤菌042BM盐敏感突变株筛选及生理研究
2.1 前言
2.2 材料与方法
2.3 结果
2.3.1 盐敏感突变株的获得及耐盐性分析
2.3.2 Tn5-luxAB探针的设计和制备
2.3.3 突变株中Tn5插入的验证
2.3.4 pH值、温度变化对盐敏感突变株的影响
2.3.5 盐敏感突变株在其它渗透压条件下的生长
2.4 讨论
第三章 苜蓿中华根瘤菌042BM与耐盐有关基因的克隆与分析
3.1 前言
3.2 材料与方法
3.3 结果
3.3.1 转座子Tn5插入位点侧翼序列的克隆策略
3.3.2 基因克隆
3.3.3 Tn5插入位点两端DNA片段的序列分析
3.3.4 盐敏感突变株中Tn5插入的定位分析
3.4 讨论
第四章 greA基因的克隆及功能互补研究
4.1 前言
4.2 材料与方法
4.3 结果
4.3.1 042BM greA基因全长的获得
4.3.2 含042BM greA基因的重组质粒pMCS5G的构建
4.3.3 042BM greA基因的功能互补研究
4.4 讨论
第五章 relA基因的克隆及功能研究
5.1 前言
5.2 材料与方法
5.3 结果
5.3.1 042BM relA基因全长的获得
5.3.2 relA的序列分析
5.3.3 对大肠杆菌relA突变株互补的研究
5.3.4 对盐突变株W11互补的研究
5.3.5 relA突变对042BM结瘤的影响
5.4 讨论
结论
参考文献
致谢
作者简介
发布时间: 2005-07-18
参考文献
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