论文摘要
目的1.建立鉴定分枝杆菌不同种及种内不同株的16S rRNA基因和16S-23SrRNA ITS序列分析方法,进一步了解16S rRNA基因和16S-23S rRNA ITS在菌种和菌株鉴定中的应用价值,了解其能鉴定的分枝杆菌种类和数量。2.掌握123种共213株分枝杆菌参考菌株的16S rRNA基因5′端和16S-23S rRNA ITS序列,补充基因数据库的不足。方法1.根据分枝杆菌16S rRNA基因和16S-23S rRNA ITS序列属特异性保守区设计引物,对123种（共213株）分枝杆菌的16S rRNA基因5′端和16S-23S rRNA ITS序列分别进行PCR扩增、序列测定,用Clustalx 1.83软件对不同种及种内不同株分枝杆菌的16S rRNA基因5′和16S-23S rRNA ITS分别进行同源性多序列比对,并用邻位相连法（Neighbour Joining,N-J法）绘制聚类分析树状谱,使用DNA STAR的MegAlign软件计算种间及种内不同株之间的相似性百分比。结果1.完成119种共包括209株分枝杆菌的16S rRNA基因测序工作,完成123种共包括213株分枝杆菌的16S-23S rRNA ITS测序工作。2.在做种间分析时发现3株鸟分枝杆菌复合群成员的16S rRNA基因序列、16S-23SrRNA ITS分别完全相同;5株结核分枝杆菌复合群成员的16S rRNA基因、16S-23S rRNAITS分别完全相同;海分枝杆菌与溃疡分枝杆菌16S rRNA基因、16S-23s rRNA分别完全相同;两种靶基因均不能将以上分枝杆菌相互鉴别。16S rRNA基因不能鉴别的还有结核分枝杆菌95052（ATCC35810）与其他5株结核分枝杆菌复合群成员;胃分枝杆菌与堪萨斯分枝杆菌;产鼻疽分枝杆菌与塞内加尔分枝杆菌;龟分枝杆菌与脓肿分枝杆菌;猪分枝杆菌与M.boenickei;母牛分枝杆菌（95050）与南非分枝杆菌;M.peregrinum与M.septicum;M.vanbaalenii与母牛分枝杆菌（95051）;M.frederiksbergense与浅黄分枝杆菌;M.murale与东海分枝杆菌;但16S-23S rRNA ITS可以将以上分枝杆菌相互鉴别。16S-23S rRNA ITS不能鉴别的还有副结核分枝杆菌与鸟分枝杆菌复合群;千田分枝杆菌、田野分枝杆菌与5个结核分枝杆菌复合群成员:金色分枝杆菌与东海分枝杆菌;抗热分枝杆菌与副偶然分枝杆菌;M.vanbaalenii与南非分枝杆菌;微黄分枝杆菌与灰尘分枝杆菌;奥布分枝杆菌与母牛分枝杆菌;杜氏分枝杆菌与猪分枝杆菌;M.hassiacum与M.pyrenivorans但16S rRNA基因可以将以上分枝杆菌相互鉴别。3.在对其中7种包括97株分枝杆菌进行种内不同株序列分析时发现16S rRNA基因可将13株草分枝杆菌分为3个基因型,18株偶发分枝杆菌分为6个基因型,17株耻垢分枝杆菌分为4个基因型,8株戈登分枝杆菌分为3个基因型,9株龟分枝杆菌龟亚种分为3个基因型,15株堪萨斯分枝杆菌分为2个基因型,17株产鼻疽分枝杆菌分为1个基因型;而16S-23S rRNA可依次将上述分枝杆菌分为3个,15个,7个,3个,4个,3个,5个基因型。结论1.16S rRNA基因和16S-23S rRNA ITS序列分析是分枝杆菌菌种鉴定的良好方法,两种方法结合可在很短时间内将除鸟分枝杆菌复合群、结核分枝杆菌复合群、海分枝杆菌与溃疡分枝杆菌之外的大部分（123种中的113种）分枝杆菌鉴定到种。2.16S-23S rRNA ITS的种内多态性较16S rRNA基因强,不仅能鉴别16S rRNA基因能鉴别的菌株,还能鉴别16S rRNA基因无法鉴别的菌株。与16S rRNA基因相比16S-23SrRNA ITS更适合种内不同株的分型和鉴定。3.所有菌株的基因序列均可做为临床上分枝杆菌鉴定的标准参考序列,补充了基因数据库的不足,为下一步分枝杆菌菌种鉴定探针的设计、基因芯片的研究打下良好基础,并为分枝杆菌背景资料研究提供重要的基础资料。