论文题目: PIN1反义基因对人骨肉瘤的抑制作用
论文类型: 博士论文
论文专业: 矫形外科
作者: 熊文化
导师: 陈安民
关键词: 多肽脯氨酰基顺反异构酶,反义基因,真核表达载体,免疫组织化学,基因转染,骨肉瘤,细胞增殖
文献来源: 华中科技大学
发表年度: 2005
论文摘要: 【目的】(1)探讨Pin1蛋白的表达与骨肉瘤组织生物学行为之间的关系;(2)克隆正、反义人PIN1基因(hPIN1)及构建hPIN1基因正、反义真核表达载体;(3)观察以pIRES2-EGFP质粒为载体的PIN1反义基因转染对人骨肉瘤细胞增殖的抑制作用。【方法】(1)用免疫组织化学ABC法对42例骨肉瘤组织中Pin1蛋白的表达进行检测;(2)应用RT-PCR技术从人骨肉瘤细胞系MG-63细胞总RNA中成功扩增出0.990kbp包含hPIN1基因编码区的cDNA序列,按正、反方向加上BamHⅠ及HindⅢ双酶切位点后形成正、反义hPIN1基因,然后连入含BamHⅠ及HindⅢ双酶切位点的pIRES2-EGFP表达质粒上,构建正、反义hPIN1基因的重组真核表达质粒phPIN1。经BamHⅠ及HindⅢ双酶切后证实正、反义表达载体构建成功;(3)用不同量(0、20、50、100、200、250μl)的以pIRES2-EGFP质粒为载体包装的反义PIN1基因转染人骨肉瘤细胞系MG-63细胞,收集转染前后的培养细胞和上清液,用MTT法观测转染前后细胞生长曲线;用流式细胞仪观测细胞生长周期变化和细胞凋亡情况;用免疫印迹法(Western-blot)检测Pin1蛋白的表达变化;用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测PIN1mRNA的表达变化。【结果】(1) 42例骨肉瘤组织中Pin1蛋白的表达率为63.5%,在对照组的10例正常外伤性截肢者的骨软骨组织中未见其表达;Pin1蛋白的表达与骨肉瘤的临床分期有关,但与患者的性别、年龄、肿瘤部位、Price组织学分级及是否有软组织侵犯无关;(2)扩增的cDNA经测经序与基因文库完全一致;BamHⅠ及HindⅢ双酶切后,正、反义表达质粒形成5. 3 + 0.990kbp两条带,与理论计算值完全一致;(3) MTT法和流式细胞仪显示反义PIN1基因转染能抑制细胞生长,促进其凋亡;Western-Blot结果表明转染反义PIN1基因的量越多,其灰度越低,测得空白对照组及不同量(0、20、50、100、200、250μl)的转染基因组其相应的吸光度比值分别为0. 854±0. 136、0. 866±0. 138、0. 732±0. 154、0. 611±0. 121、0. 547±0. 109、0. 398±0. 113、0. 320±0. 151 ,差异有显著性( P < 0.05) ;RT-PCR检测其灰度比值分别为0. 983±0. 125、0. 988±0. 127、0. 915±0. 157、0. 786±0. 125、0. 608±0. 124、0. 433±0. 130、0. 410±0. 158,差异有显著性( P < 0.05)。【结论】(1) PIN1基因可能在骨肉瘤的发生发展中起重要作用,可能为骨肉瘤的基因治疗提供了新的靶点;(2)成功克隆正、反义人PIN1基因及构建hPIN1基因的正、反义真核表达载体;(3)反义PIN1基因可封闭PIN1mRNA,使已转染反义PIN1基因的MG-63细胞表达的Pin1蛋白减少,从而抑制人骨肉瘤细胞MG-63增殖。
论文目录:
中文摘要
英文摘要
前言
实验一 Pi111 蛋白在骨肉瘤组织中的表达及其临床意义
1 材料与方法
2 结果
3 讨论
参考文献
实验二 正反义人PIN1 基因克隆及真核表达载体的构建
1 材料和方法
2 结果
3 讨论
参考文献
实验三 PIN1 反义基因转染抑制人骨肉瘤细胞的增殖
1 材料与方法
2 结果
3 讨论
参考文献
全文总结
综述一 一种肿瘤发生的催化分子脯氨酰同分异构酶Pi111
综述二 四肢恶性骨肿瘤治疗的若干进展
缩略词及部分溶液配制说明
博士期间发表的文章
致谢
发布时间: 2008-02-19
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