论文摘要
第一部分：大鼠肝移植模型的建立和移植肝内CD4+CD25+调节性T细胞的变化目的：建立稳定的大鼠肝移植模型，并检测大鼠移植肝内CD4+CD25+调节性T细胞比例的变化。方法：采用近交系成年雄性DA、LEW大鼠为供受体，改良“二袖套”法建立肝脏移植模型42例。术前随机分为3组：排斥组（DA→LEW，n=12），耐受组（LEW→DA，n=15），同基因组（DA→DA，n=15）。术后4、7、10d随机各处死2例，收集肝脏标本和血标本，后两组术后30d各处死3例，收集肝脏标本和血标本。分离肝组织内淋巴细胞，由流式检测CD4+CD25+T细胞比例。每组留6例来观察生存期，存活＞60d时采血样，并处死3只，血标本检测AST、BILI浓度，肝脏标本观察移植物病理学变化。结果：术后4d，三组均表现为高AST和低BILI，各组之间无统计学差异。术后7、10d排斥组血清AST、BILI浓度均明显高于其余两组（P＜0.05）。术后60d，耐受组和同基因组血清AST、BILI浓度正常，两组间无统计学差异（P＞0.05）。术后7d，排斥组肝脏病理表现为汇管区大量淋巴细胞浸润，并累及胆管、血管，肝小叶结构消失，伴有局灶性的出血、坏死，Banff评分Ⅲ级。耐受组汇管区表现为中等量的淋巴细胞浸润，未侵及肝实质、胆管和血管，Banff评分Ⅰ-Ⅱ级，同基因组汇管区为少至中等量淋巴细胞浸润，胆管、血管未受侵犯，Banff评分0-Ⅰ级。各组的中位生存期：排斥组为12d，耐受组106d，同基因组128d。排斥组生存时间明显短于其他两组（p＜0.01），耐受组和同基因组之间无统计学差异（p＞0.05）。肝移植早期，急性排斥组和自发耐受组的移植肝内CD4+CD25+Tr细胞比例均增加，约在4d时达到高峰，急性排斥组的急性排斥反应最为明显。移植后30d，自发耐受组受者的移植肝内CD4+CD25+T细胞比例达到第二次高峰，在移植后60d时仍维持在较的高水平。结论：DA与LEW大鼠组合可建立稳定可靠的肝脏急性排斥模型与自发耐受模型，两种模型的肝功能变化、移植物病理表现、生存期分别符合急性排斥和自发耐受的特点。自发耐受模型肝内CD4+CD25+T细胞亚群比例变化趋势，与其他学者报道的调节细胞变化趋势一致，说明调节细胞可能参与自发免疫耐受的形成。第二部分：MACS双阳性法分选大鼠外周血内的CD4+CD25+T细胞目的：利用细胞磁分离系统（MACS）高效快速的分离大鼠外周血CD4+CD25+调节性T细胞。方法：采用免疫磁珠两步法分离大鼠外周血内的CD4+CD25+调节性T细胞，首先采用Anti-rat CD4-APC和Anti-APC MultiSort MicroBeads阳性分选出CD4+细胞，再用Anti-rat CD25-PE和Anti-PEMicroBead阳性分选获得CD4+CD25+T细胞。分离后的细胞经流式细胞仪检测分离纯度和细胞活性；体外增殖实验检测其对CD4+CD25-T细胞的免疫抑制作用。RT-PCR检测CD4+CD25+T细胞中Foxp3基因的表达。结果：双阳性分选后获得的CD4+CD25+T细胞纯度为94.2％±1.1％（87％～98％），细胞存活率93.8％±3.4％（93％～95％），体外增殖实验表明CD4+CD25+T细胞能明显抑制CD4+CD25-T细胞的增殖（CD25+／CD25- vs CD25-，P＜0.01）。分离得到的CD4+CD25+T细胞中有明确的Foxp3基因的表达。结论：采用MACS系统双阳性分选可以高效、快速的获得理想纯度和免疫抑制功能的大鼠CD4+CD25+调节性T细胞。第三部分：自发免疫耐受大鼠移植肝内转录因子Foxp3的表达目的：探讨大鼠同种异体肝移植肝内转录因子Foxp3的变化与自发免疫耐受的关系。方法：利用第一部分耐受组和同基因组肝移植后4d、7d、10d、30d、60d冻存的肝组织，通过实时荧光定量PCR、检测大鼠移植肝内Foxp3 mRNA的表达；Western-Blot检测肝内Scurfin含量的变化。结果：大鼠肝移植早期Foxp3 mRNA及其蛋白产物Scurfin的明显下降，在7d左右开始上升，10d达到峰值，30d后Foxp3 mRNA表达水平开始下降，但仍高于正常值。结论：转录因子Foxp3可能参与大鼠肝脏移植自发免疫耐受的形成。
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标签：大鼠论文; 近交系论文; 肝移植论文; 免疫反应论文; 排斥论文; 耐受论文; 细胞磁分离论文; 调节性细胞论文; 免疫耐受论文;