P物质联合表皮干细胞促进糖尿病创面愈合与神经再生的实验研究

论文摘要

目的：探讨糖尿病大鼠表皮干细胞体外分离培养的方法及其生物特性,观察P物质联合表皮干细胞对糖尿病大鼠创面愈合与神经再生的影响,为糖尿病创面的修复提供一种新技术方法,为进一步临床应用奠定实验依据和理论基础。方法：1)SD大鼠随机分成糖尿病组和正常对照组。糖尿病组采用一次性腹腔注射链脲佐菌素（streptozocin, STZ,65mg/kg）制备糖尿病大鼠模型,正常对照组不作处理。分别取成模糖尿病和正常大鼠背部全层皮肤,采用胰蛋白酶和乙二胺四乙酸联合消化法分离表皮,Ⅳ型胶原黏附法纯化培养表皮干细胞。倒置相差显微镜下观察细胞形态变化和细胞克隆形成,细胞计数绘制生长曲线,计算克隆形成率,免疫细胞化学染色法鉴定K19、β1-integrin阳性表达,图像分析软件测定阳性细胞的积分吸光度（IA）值。2)取成功建模的糖尿病大鼠48只,于背部脊柱两侧以特制打孔器致直径1.8cm全层皮肤缺损创面,每只大鼠四个创面用随机抽签法随机分为四组（A组：表皮干细胞+P物质组；B组：表皮干细胞组；C组：P物质组；D组：单纯羊膜对照组）其中A、B两组分别用羊膜负载的表皮干细胞移植修复；A、C两组分别于移植后在创周及创中注射10-7mol/L的P物质250μ1,B组和D组同等条件下注射P物质溶剂作对照,每日2次,连用4天。动态观察各组创面愈合情况；创面组织HE染色观察组织学变化；免疫组织化学Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、PGP9.5和P物质染色观察创面胶原变化与创面神经再生情况。结果：1)糖尿病组大鼠表皮干细胞原代贴壁数量较少,其克隆形成率为7.43%±1.21%,明显低于正常对照组的15.37%±2.03%,差异有统计学意义（P<0.01）。两组表皮干细胞的K19、β1-integrin均呈阳性表达,糖尿病组阳性细胞的IA值分别为86.17±10.54、26.35±7.63,均低于正常对照组的160.31±36.52、59.46±14.67,差异均有统计学意义（P<0.01）。2)与B、C和D组相比较,A组创面愈合时间明显缩短,皮肤组织中Ⅰ型、Ⅲ型胶原含量明显增多。A、C两组创面组织中有大量PGP9.5和P物质阳性表达神经纤维再生,部分神经纤维末梢向表皮延伸接近表皮组织。B、D组仅见创面组织深层有少量PGP9.5和P物质阳性神经纤维组织表达,未见神经纤维末梢向表皮延伸。结论：1)在本培养体系条件下能成功的分离培养糖尿病大鼠表皮干细胞,其体外增殖能力较正常皮肤增殖能力弱,可能是导致糖尿病创面难愈的重要因素之一。2)联合应用外源性SP和表皮干细胞可有效促进糖尿病创面愈合与神经再生,为糖尿病创面的修复提供一种新技术方法,为进一步临床应用奠定实验依据和理论基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 前言
• 第2章 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 糖尿病大鼠模型建立
• 2.2.2 表皮干细胞分离培养
• 2.2.3 免疫细胞化学染色检测
• 2.2.4 细胞克隆形成率的测定
• 2.2.5 表皮干细胞生长曲线测定
• 2.2.6 羊膜载体构建
• 2.2.7 动物实验分组
• 2.2.8 创面愈合观察
• 2.2.9 组织病理学检测
• 2.3 统计学处理
• 第3章 结果
• 3.1 糖尿病大鼠成模观察
• 3.2 培养的表皮干细胞生物学特性
• 3.3 表皮干细胞鉴定与图像分析
• 3.4 表皮干细胞克隆形成率
• 3.5 表皮干细胞生长曲线
• 3.6 羊膜载体的构建情况
• 3.7 创面愈合与组织学观察
• 3.8 总胶原Masson特染结果
• 3.9 Ⅰ型和Ⅲ型胶原免疫组化染色结果
• 3.10 PGP9.5免疫组化染色结果
• 3.11 感觉神经肽P物质（SP）免疫组化染色结果
• 第4章 讨论
• 4.1 糖尿病大鼠表皮干细胞的体外分离培养的可行性与意义
• 4.2 P物质联合表皮干细胞对糖尿病创面的促愈作用和神经再生机制的探讨
• 第5章 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读学位期间的研究成果
• 综述
• 参考文献