活细胞内脊髓灰质炎病毒正链RNA可视化研究

论文题目: 活细胞内脊髓灰质炎病毒正链RNA可视化研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 微生物学

作者: 崔宗强

导师: 张先恩

关键词: 活细胞,脊髓灰质炎病毒正链,可视化,分子信标,定位,运动,微管,膜重排

文献来源: 中国科学院研究生院（武汉病毒研究所）

发表年度: 2005

论文摘要: 病毒核酸在寄主细胞内定位和运动的监测分析对于理解病毒与宿主细胞间的相互作用具有重要意义。但是迄今为止,要实现病毒核酸在寄主细胞内定位和运动的分析,特别是要实现病毒核酸在活细胞内的动态学及其控制机制的分析,还存在方法学上的不足和挑战。利用分子信标技术和脊髓灰质炎病毒-Vero 细胞作为模型病毒-细胞系统,本研究建立了一种在活的寄主细胞内实现病毒核酸可视化的方法。当把目标RNA特异性的分子信标探针引入脊髓灰质炎病毒感染的Vero 细胞内时,内源的脊髓灰质炎病毒的正链RNA 可以在活细胞内被标记照亮。在荧光显微镜下可以直接监测脊髓灰质炎病毒的正链RNA 在活细胞内的定位和运动。这一结果也证明了分子信标是实现病毒核酸在活细胞内可视化的有力工具。运用长时间活细胞荧光影像捕获和荧光漂白恢复等技术手段,研究了脊髓灰质炎病毒正链RNA 在活细胞内的行为特征。在病毒感染后的不同时间,脊髓灰质炎病毒正链RNA 在寄主活细胞内展示不同的分布模式。实时监测发现脊髓灰质炎病毒正链RNA 在Vero 细胞内的分布变化是一个特征性的RNA 移位过程。由于这一移位过程类似于脊髓灰质炎病毒诱导的特异性膜泡在寄主细胞内的重排过程,我们把这种RNA 移位也称为RNA 的重排。脊髓灰质炎病毒正链RNA 特征性的移位和重排需要寄主细胞完整的微管网络,破坏微管网络可以改变RNA 的分布模式。荧光漂白恢复检测显示约有49.4 ±3.2%的脊髓灰质炎病毒正链RNA 在其分布区域内部可以自由扩散运动(扩散系数为9.6 ±1.6×10-10cm2/s),其余的50.5 ±2.9%在FRAP 测定期间几乎静止不动,而只是随着整个RNA 分布区域的变化缓慢移动。活细胞内的研究揭示了脊髓灰质炎病毒正链RNA 以一种受限制和自由扩散相混合的复杂的分布和运动机制存在于寄主细胞。这种机制主要与寄主细胞的微管和病毒诱导的膜结构有关。这一病毒核酸在活的寄主细胞的动态行为的研究也让我们对脊髓灰质炎病毒和寄主细胞的相互作用有了更深的理解。通过电子显微镜的观察,发现脊髓灰质炎病毒诱导的膜重排过程也与微管组织有关。结合文献资料和本研究的发现,我们猜想脊髓灰质炎感染细胞后,伴随膜重排的过程,寄主细胞内还可能有一个特征性的微管重排过程。

论文目录:

第1章 引言

1 活细胞内 RNA 可视化的研究进展

1.1 活细胞内 RNA 的可视化技术

1.1.1 显微注射荧光标记的 RNA

1.1.2 利用 GFP 及其变体建立的活细胞内 RNA 标记系统

1.1.2.1 利用M52-GFP融合蛋白和可与M52结合的RNA序列建立的活细胞内 RNA 标记系统

1.1.2.2 通过GFP标记与目标RNA特异结合的蛋白质来标记RNA

1.1.2.3 利用 Lac 操纵子建立的活细胞内基因表达可视系统

1.1.3 利用荧光标记的核酸探针标记活细胞内的 RNA

1.1.3.1 寡聚脱氧核苷酸探针

1.1.3.2 光敏物质包被的寡核苷酸探针

1.1.3.3 2’甲基化的RNA 探针

1.1.3.4 携带性能可变的荧光染料的寡核苷酸探针

1.1.3.5 分子信标

1.1.3.6 其他类型的 FIVH 探针

1.1.4 细胞渗透性荧光染料

1.1.4.1 带荧光分子的单核苷酸

1.1.4.2 SYTO-14

1.2 活细胞内 RNA 运动的定性和定量分析技术

1.2.1 荧光漂白恢复技术

1.2.2 荧光漂白损失技术

1.2.3 反向 FRAP

1.2.4 荧光相关光谱

1.2.5 光激活分析

1.2.6 长时间活细胞荧光影像捕获技术

1.3 活细胞内 RNA 运动及控制机理的研究进展

1.3.1 哺乳动物细胞核内RNA 的定位和运动

1.3.2 哺乳动物细胞质中 RNA 的定位和运动

1.3.3 酵母细胞中RNA 的定位和运动

1.3.4 果蝇卵母细胞中 RNA 的定位和运动

1.3.5 神经细胞中 RNA 的定位和运动

2 脊髓灰质炎病毒简介

3 本研究的主要目标及研究内容

第2章 活细胞内脊髓灰质炎病毒正链 RNA 的可视化

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒株和细胞株

1.1.2 主要试剂及来源

1.1.3 培养液及配方

1.1.4 主要溶液与缓冲液

1.1.5 仪器设备

1.2 试验方法

1.2.1 探针设计和合成

1.2.2 细胞培养和病毒的增殖

1.2.3 病毒浓缩和 RNA 的提取

1.2.4 病毒感染的 Vero 细胞的制备

1.2.5 体外杂交

1.2.6 荧光原位杂交

1.2.7 活细胞内病毒核酸的可视化成像

2 结果与分析

2.1 体外杂交

2.2 荧光原位杂交

2.3 转染过程分析

2.4 活细胞内病毒核酸的可视化定位

3 讨论

第3章 活细胞内脊髓灰质炎病毒正链 RNA 动态学分析

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 实时监测

1.2.2 药物处理

1.2.3 荧光漂白恢复分析

2 结果与分析

2.1 实时监测脊髓灰质炎病毒正链RNA在活细胞内的移位过程

2.2 微管对脊髓灰质炎病毒的正链RNA 定位和运动的影响

2.3 荧光漂白恢复试验分析结果

3 讨论

第4章 脊髓灰质炎病毒特异性膜泡运动机制的探索

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 病毒感染的 Vero 细胞的制备

1.2.2 电镜样品制备与观察

2 结果与分析

2.1 脊髓灰质炎病毒诱导的特异性膜泡及其在寄主细胞内的分布

2.2 微管网络对病毒特异性膜泡分布和移位的影响

3 讨论

第5章 结论

参考文献

发表和待发表文章

致谢

发布时间: 2005-12-02

参考文献

• [1].脊髓灰质炎病毒壳体蛋白热动力学分析与缺陷型重组载体的构建研究[D]. 李琦涵.中国协和医科大学1998
• [2].单细胞技术在正链RNA病毒研究中的应用[D]. 黄璇.武汉大学2010

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