吸水链霉菌17997中格尔德霉素生物合成基因簇的研究

论文摘要

吸水链霉菌17997（Streptomyces hygroscopicus 17997）是我所从中国土壤中分离得到的格尔德霉素（geldanamycin，GDM）产生菌。GDM属于苯安莎类抗生素。最先发现GDM具有抗原虫和抗肿瘤作用，最近我所的研究发现GDM还具有良好的抗病毒活性。国外的研究表明GDM的这些生物学活性是因为它能特异性地抑制热休克蛋白90的ATP／ADP结构域，下调多种Hsp90的靶蛋白功能所致，包括酪氨酸激酶、类固醇激素受体和转录因子等。GDM作为Hsp90的特异性抑制剂，成为在抗癌和抗病毒领域中非常有潜力的药物。但因为GDM肝毒性比较大，水溶性不好，所以寻找其低毒可溶性好的衍生物成为当今研究的主要目标。GDM的一种衍生物17—烯丙氨基—17—脱甲氧基GDM（17-AAG）正在美国进行Ⅱ期临床实验。 已知安莎类抗生素的生物合成是以3—氨基—5—羟基苯甲酸（AHBA）为起始单位，由Ⅰ型聚酮合酶（PKS）催化顺序加上乙二酸，丙二酸或者甲氧基丙二酸等延伸单位，在酰胺合酶参与下形成聚酮体骨架，然后再进行后续的加工（post PKS modification）。在对GDM生物合成基因簇的研究中，本实验室在S．hygroscopicus 17997中曾发现了苯醌型和萘醌型两种AHBA生物合成基因和与之连锁的两个PKS基因簇，但其中未包括GDM的后修饰基因。本研究根据GDM的后修饰基因—氨甲酰基转移酶基因（gdmN）的保守序列设计PCR引物，在S．hygroscopicus 17997基因组中扩增出了732bp的基因片段，通过测序和同源比较，证实该基因片段与S．hygroscopicus NRRL 3602的gdmN有94％的同源性。利用该基因片段的引物，进行菌落PCR筛选S．hygroscopicus 17997的基因组文库，获得了6个阳性克隆，并利用732bp的PCR产物作为探针对阳性克隆进行Southern blot验证和定位。选择CT-4阳性柯斯质粒进行亚克隆测序，将测得的28.356kb DNA序列进行BLAST和ORF分析，证实与公布的S．hygroscopicus NRRL3602 GDM生物合成基因的部分序列基本一致。CT-4柯斯质粒克隆中外源序列可能包括12个基因：与gdmA3基因同源的PKS基因、酰胺合酶基因（gdmF）、单加氧酶基因（gdmM）、氨甲酰基转移酶基因（gdmN）、与甲氧基丙二酰—酰基携带蛋白合成相关的5个基因（gdmH、I、J、K和G）、LuxR家族的转录调节基因（gdmRⅡ）、氨基

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 英文缩略语（Abbreviation）
• 前言
• 第一部分 GDM生物合成基因簇的克隆与生物信息学分析
• 一.实验材料与方法
• 1.实验材料
• 1.1 生物信息学分析工具
• 1.2 菌种
• 1.3 载体
• 1.4 特殊试剂与酶
• 1.5 实验仪器
• 1.6 培养基
• 1.7 常用缓冲液
• 2.实验方法
• 2.1 E.coli质粒DNA小量提取
• 2.2 限制酶切反应
• 2.3 DNA电泳及片段回收
• 2.4 去磷酸化反应
• 2.5 DNA连接反应
• 2.6 链霉菌总DNA提取方法
• 2.7 少量快速提取链霉菌总DNA
• 2.8 PCR反应
• 2.9 从基因文库筛选阳性克隆的菌落PCR方法
• 2.10 Southern杂交
• 二.结果与讨论
• 1.氨甲酰基转移酶（carbamoyltransferase,CT）基因的克隆
• 2.Streptomyces hygroscopicus 17997中与gdmN（CT）基因连锁的GDM生物合成基因簇的获得
• 2.1 CT基因阳性柯斯质粒克隆的获得
• 2.2 CT基因在阳性克隆中的定位
• 2.3 CT-4的亚克隆序列测定与生物信息学分析
• 2.4 Streptomyces hygroscopicus 17997中GDM部分生物合成基因簇连锁图
• 第二部分 GDM重要生物合成基因的阻断与阻断变株产生相应次级代谢产物的鉴定
• 一.实验材料与方法
• 1.实验材料
• 1.1 菌种
• 1.2 载体和基因
• 1.3 抗生素
• 1.4 化学试剂
• 1.5 硅胶柱和凝胶柱
• 1.6 实验仪器
• 1.7 培养基
• 2.实验方法
• 2.1 大肠杆菌ET12567／pUZ8002与吸水链霉菌17997接合转移的方法
• 2.2 发酵培养
• 2.3 发酵培养物的提取和组分鉴定
• 2.4 色谱分析方法
• 二.结果与讨论
• 1.吸水链霉菌17997基因导入方法和载体的选择
• 2.AHBA生物合成基因的阻断及其鉴定
• 2.1 gdnA-O-P和shnS-O-P基因阻断载体的构建
• 2.2 基因阻断变株GA和SA的筛选和鉴定
• 3.PKS、gdmN和gdmM基因阻断和发酵产物的鉴定
• 3.1 PKS、gdmN和gdmM基因阻断载体的构建
• 3.2 PKS、gdmN和gdmM基因阻断变株的筛选和鉴定
• 3.3 gdmN基因阻断变株发酵产物的分离鉴定和变株回复实验
• 4.gdmN基因阻断株（CT-1）产生的两种主产物的结构解析
• 4.1 CT-1-7的化学结构鉴定
• 4.2 gdmN基因阻断株（CT-1）发酵产物的监测
• 4.3 GDM、CT-1-7和CT-1-1的质谱数据比较
• 4.4 CT-1-1产物的化学结构鉴定
• 第三部分 GDM生物合成调节基因的研究
• 一.实验材料与方法
• 1.实验材料
• 1.1 菌种
• 1.2 载体
• 1.3 特殊试剂
• 1.4 实验仪器
• 1.5 培养基及缓冲液
• 2.实验方法
• 2.1 链霉菌Streptomyces lividans TK24原生质体的制备、再生及DNA转化
• 2.2 RNA提取实验器具的处理与准备：
• 2.3 链霉菌总RNA的提取（TRIzol法）
• 2.4 总RNA定量
• 2.5 总RNA的纯化
• 2.6 两步法RT-PCR
• 二.结果与讨论
• 1.gdmRⅠ和gdmRⅡ基因阻断实验
• 1.1 gdmRⅠ和gdmRⅡ基因阻断载体的构建
• 1.2 gdmRⅠ和gdmRⅡ基因阻断株的筛选
• 1.3 gdmRⅠ和gdmRⅡ的基因阻断株的PCR鉴定
• 1.4 gdmRⅠ和gdmRⅡ的基因阻断株发酵抗菌活性的测定
• 1.5 gdmRⅠ和gdmRⅡ的基因阻断株发酵产物的HPLC鉴定
• 2.gdmRⅠ和gdmRⅡ调节基因在转录水平上的研究
• 2.1 吸水链霉菌17997生理代谢的研究
• 2.2 RT-PCR检测在原株中gdmRⅠ和gdmRⅡ的转录活性
• 2.3 RT-PCR检测GDM主要生物合成基因在原株中的转录活性
• 2.4 RT-PCR检测GDM主要生物合成基因在调节基因阻断株中的转录活性
• 3.转录调节基因gdmRⅠ、gdmRⅡ启动子区的初步定位
• 结论
• 参考文献
• 文献综述
• 致谢
• 附录
• 博士在读期间发表的学术论文