香菇多糖提取和β-葡萄糖苷酶应用研究

论文摘要

香菇中的香菇多糖具有抗癌、抗肿瘤等多种生物活性。香菇β-葡萄糖苷酶在食品加工、生产中有着广泛的应用。本试验以香菇为原料,探索从其中提取香菇β-葡萄糖苷酶,水解大豆异黄酮和豆渣;提取香菇β-葡萄糖苷酶后剩余的香菇渣中还含有部分的香菇多糖,对其进一步提取纯化,主要通过热水浸提、超声辅助提取、微波辅助提取和亚临界水提取四种方法提取香菇多糖,醇沉后并用Sevag法除去香菇多糖中的蛋白。并测定香菇多糖的抗氧化活性。测定多糖的方法主要是用3.5-二硝基水杨酸法测定还原糖的含量,通过苯酚-硫酸法测定溶液中的总糖的含量,换算得到多糖的含量。本试验对苯酚-硫酸方法进行了进一步研究,确定了该方法有很好的稳定性和重现性,确定测定多糖最佳波长为490nm,最佳的提取液稀释倍数为200倍。采用热水浸提法提取香菇多糖时,通过单因素试验和正交试验,确定了最佳的热水浸取条件:提取温度100℃,液固比40mL/g,提取时间3h,提取2次。采用超声辅助法提取香菇多糖时,通过单因素试验和正交试验,确定了最佳超声辅助提取条件:提取温度70℃,超声时间45min,液固比30mL/g,超声功率80W,提取2次。采用微波辅助法提取香菇多糖时,通过单因素试验和正交试验,确定了最佳微波辅助提取条件:浸提温度90℃,微波萃取时间10min,液固比25mL/g,微波功率是800W,提取2次。采用亚临界水法提取香菇多糖时,通过单因素试验和正交试验,确定了最佳亚临界水法提取条件:亚临界水温度150℃,液固比30mL/g,浸提时间为5min,浸提次数为2次。四种方法最佳条件下提取香菇多糖得率为:热水浸提法4.90%,超声辅助提取法5.17%,微波辅助提取法4.83%,亚临界水法7.63%;提取时间依次为:3h,45min,10min,5min;液固比依次为40mL/g,30mL/g,25mL/g,30mL/g;提取温度依次为100℃,70℃,90℃,150℃。由以上数据可知,热水浸提法提取香菇多糖的耗时最长,料液比较大,温度要求高;超声辅助提取法相对于传统热水浸提法,提取时间缩短很多,液固比也减小,温度要求最低。微波辅助提取法提取时间相对于以上两种方法提取时间又缩短一些,液固比也相对减小,但是香菇多糖的得率稍微有所下降。亚临界水提取方法提取率最高,提取瞬间完成。在实际生产过程中,要根据实际情况选择适宜的提取方法。通过醇沉试验选择的最佳乙醇醇析终浓度为80%。Sevag法除蛋白的选定因素、水平进行正交试验。得到Sevag法对香菇多糖提取液除蛋白的最优条件振荡时间为2min、静置时间20min、样液与Sevag试剂体积比为2:1、氯仿与正丁醇体积比为3:1。粗多糖样品经四次Sevag法纯化多糖纯度达到92.26%。进行了香菇β-葡萄糖苷酶水解豆渣的研究。香菇β-葡萄糖苷酶水解鲜豆渣试验中,水溶性多糖含量由0.21g/L增加到0.27g/L;水解55℃下烘干豆渣试验中,水溶性多糖含量由0.80g/L增加到1.24g/L;水解90℃下烘干豆渣试验中,水溶性多糖含量由0.52g/L增加到0.78g/L。采用豆渣酶解途径进行放大实验,取55℃下烘干豆渣100g,选用香菇β-葡萄糖苷酶进行水解,水溶性多糖含量由0.82g/L增加到1.26g/L,水溶性多糖含量增加了54%。进行了香菇β-葡萄糖苷酶水解大豆异黄酮的研究。香菇β-葡萄糖苷酶水解大豆异黄酮后,得到产品1.6g,黄豆苷水解率为98.15%,染料木苷水解率94.23%。对香菇多糖进行了抗氧化活性测定研究,研究结果表明,香菇多糖具有抗氧化活性,可以有效清除DPPH自由基,其清除率可达55.0%;羟基自由基清除率可达76.5%,与同浓度下的Vc接近。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 立题背景
• 1.2 β-葡萄糖苷酶的研究进展
• 1.2.1 β-葡萄糖苷酶的理化性质
• 1.2.2 β-葡萄糖苷酶的催化反应机制
• 1.2.3 β-葡萄糖苷酶活性的测定方法
• 1.2.4 β-葡萄糖苷酶的应用
• 1.3 香菇多糖的研究进展
• 1.3.1 香菇多糖理化性质
• 1.3.2 香菇多糖应用的研究
• 1.3.3 香菇多糖的临床应用研究
• 1.4 国内外香菇多糖提取方法的研究
• 1.4.1 水浸提法
• 1.4.2 酸浸提法
• 1.4.3 碱浸提法
• 1.4.4 酶提取法
• 1.4.5 超声辅助提取法
• 1.4.6 微波辅助提取法
• 1.4.7 亚临界水提取法
• 1.5 多糖的定量方法
• 1.6 香菇多糖中除蛋白的方法比较及蛋白测定
• 1.6.1 Sevag 法除蛋白
• 1.6.2 三氟三氯乙烷法
• 1.6.3 三氯乙酸法
• 1.6.4 酶法脱蛋白
• 1.6.5 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量
• 1.7 立题意义
• 1.8 本论文主要的研究内容
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 试验原料
• 2.1.2 试验试剂
• 2.1.3 试验仪器
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 原料分析
• 2.2.2 香菇精深加工工艺路线
• 2.2.3 香菇活性物质的提取
• 2.2.4 香菇多糖的提取方法和纯化的研究
• 2.2.5 香菇β-葡萄糖苷酶的应用研究
• 2.2.6 香菇多糖的抗氧化活性研究
• 3 结果与分析
• 3.1 原料成分结果
• 3.2 香菇多糖的测定方法研究
• 3.2.1 还原糖含量测定的标准曲线
• 3.2.2 总糖测定方法的研究
• 3.3 其他成分的测定方法
• 3.3.1 蛋白质含量的快速测定方法
• 3.3.2 高效液相色谱法测定大豆异黄酮标准曲线
• 3.4 热水浸提法提取香菇多糖条件的确定
• 3.4.1 提取时间对香菇多糖得率的影响
• 3.4.2 液固比对香菇多糖得率的影响
• 3.4.3 提取温度对香菇多糖得率的影响
• 3.4.4 提取次数对香菇多糖得率的影响
• 3.4.5 正交试验结果分析及最佳提取条件的确定
• 3.5 超声辅助法提取提取香菇多糖条件的确定
• 3.5.1 提取时间对香菇多糖得率的影响
• 3.5.2 液固比对香菇多糖得率的影响
• 3.5.3 提取温度对香菇多糖得率的影响
• 3.5.4 超声功率对香菇得率的影响
• 3.5.5 提取次数对香菇多糖得率的影响
• 3.5.6 正交试验结果分析及最佳提取条件的确定
• 3.6 微波辅助法提取香菇多糖条件的确定
• 3.6.1 提取时间对香菇多糖得率的影响
• 3.6.2 液固比对香菇多糖得率的影响
• 3.6.3 提取温度对香菇多糖得率的影响
• 3.6.4 微波功率对香菇多糖得率的影响
• 3.6.5 提取次数对香菇多糖得率的影响
• 3.6.6 正交试验结果分析及最佳提取条件的确定
• 3.7 亚临界水法提取香菇多糖条件的选择
• 3.7.1 提取时间对香菇多糖得率的影响
• 3.7.2 液固比对香菇多糖得率的影响
• 3.7.3 亚临界水提取温度对香菇多糖得率的影响
• 3.7.4 提取次数对香菇多糖得率的影响
• 3.7.5 正交试验结果分析及最佳提取条件的确定
• 3.8 四种方法提取香菇多糖的比较
• 3.9 香菇多糖醇沉条件的选择
• 3.10 Sevag 法对香菇多糖除蛋白条件的研究
• 3.10.1 振荡时间对香菇多糖提取液蛋白脱除率的影响
• 3.10.2 静置时间对香菇多糖提取液除蛋白的影响
• 3.10.3 样液与Sevag 试剂体积比对香菇多糖提取液蛋白脱除率的影响
• 3.10.4 氯仿与正丁醇体积比对香菇多糖提取液蛋白脱除率的影响
• 3.10.5 蛋白质脱除最佳条件的确定
• 3.10.6 香菇多糖Sevag 法除蛋白后的纯度测定
• 3.11 香菇β-葡萄糖苷酶液的应用研究
• 3.11.1 香菇β-葡萄糖苷酶液水解豆渣的研究结果
• 3.11.2 香菇β-葡萄糖苷酶液水解大豆异黄酮的研究结果
• 3.12 香菇多糖的抗氧化活性研究
• 3.12.1 香菇多糖还原能力的测定
• 3.12.2 香菇多糖清除DPPH 自由基的测定
• 3.12.3 香菇多糖清除羟基自由基（·OH）的测定
• 4 结论
• 4.1 创新点
• 4.2 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文