东亚飞蝗对有机磷杀虫剂的抗性及其机理研究

论文摘要

东亚飞蝗Locusta migratoria manilensis（Meyen）是为害严重的农业害虫,有机磷杀虫剂是防治这一害虫使用较广的杀虫剂,为了深入探讨东亚飞蝗对有机磷杀虫剂的抗性机制,针对东亚飞蝗不同种群制定相应的治理策略,更有效地进行抗性治理,本文通过东亚飞蝗田间种群对有机磷农药的敏感性分析,探讨了东亚飞蝗对有机磷农药产生抗性的现状;同时利用现代分子生物学技术,研究分析了抗性产生的生化和分子生物学机理,主要研究内容如下:一、东亚飞蝗对有机磷农药的敏感性分析和增效作用测定本研究针对我国东亚飞蝗发生规模、分布特点、农药使用背景差异和种群遗传特征,采集了河北黄骅、海南黄流和山东无棣田间种群,选择有代表性的有机磷农药进行敏感性分析。结果发现,东亚飞蝗无棣种群对马拉硫磷最为敏感,黄骅种群对毒死蜱和辛硫磷仅有5.4和2.9倍的抗药性,而黄骅和黄流两种群对马拉硫磷已产生了57.5和14.8倍的抗药性。可以看出,由于东亚飞蝗不同种群马拉硫磷选择压力的差异已经造成不同田间种群对其抗性程度产生了变化,而且不同的有机磷农药对同一种群的选择压力已产生不同的抗药性水平。由此说明,研究东亚飞蝗对常用杀虫剂抗性发生现状,建立有效的抗性治理策略,是十分必要的。通过增效剂磷酸三苯酯（TPP）、顺丁烯二酸二乙酯（DEM）及氧化胡椒基丁醚（PBO）在河北黄骅田间种群和敏感品系中对马拉硫磷的增效试验,结果发现,无论在黄骅种群还是敏感品系中,PBO对马拉硫磷都没有增效作用（增效比分别为0.9和1.1）,但在黄骅种群中TPP和DEM对马拉硫磷表现出显著的增效作用（增效比分别为16.2和3.3）,而在敏感品系中TPP和DEM没有明显的增效作用（增效比分别为1.4和1.2）;由此推测,酯酶和谷胱甘肽S-转移酶与黄骅种群马拉硫磷抗性相关,而细胞色素P450与马拉硫磷抗性无关。二、东亚飞蝗有机磷抗性代谢解毒酶生化机制研究本研究分析了东亚飞蝗代谢解毒酶系（酯酶、谷胱甘肽S-转移酶和细胞色素P450氧化酶）的生化特性。东亚飞蝗河北黄骅种群和敏感品系代谢解毒酶活性表现出不同程度的差异,其中黄骅种群酯酶对α-NA、α-NB及β-NA三种底物的水解活性和谷胱甘肽S-转移酶对底物CDNB和DCNB水解活性显著高于敏感品系,分别是敏感品系的2.1-3.2倍和1.2-2.0倍。而对于细胞色素P450活性,两者之间没有显著差异。酯酶聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示,黄骅种群和敏感品系电泳图谱中条带带型没有差异,但黄骅种群条带染色明显深于敏感品系。据此推测,黄骅种群与敏感品系之间的酯酶活性和谷胱甘肽S-转移酶差异与河北黄骅东亚飞蝗的抗药性有关。用对氧磷、马拉氧磷两种有机磷抑制剂对东亚飞蝗海南黄流和山东无棣种群的羧酸酯酶进行体外抑制,实验结果表明,黄流和无棣种群的pI50值有显著差异,黄流种群分别是山东种群的1.16和1.27倍,说明黄流种群对对氧磷和马拉氧磷的敏感性较低。然而黄流种群和无棣种群的羧酸酯酶活性测定结果表明,以α-NA和β-NA为底物时,无棣种群羧酸酯酶活性分别是黄流种群1.75和1.50倍,具有显著差异。动力学研究表明,无棣种群和黄流种群的羧酸酯酶K和Vmax值没有显著差异。据分析黄流种群和无棣种群羧酸酯酶活性的差异可能是由于生态环境的不同所导致的种群分化引起的。根据目前的研究结果尚难以断定对马拉硫磷生物测定中LD50值较低的无棣种群对其它农药的敏感性如何。基于无棣种群较高的羧酸酯酶活性,我们推测,东亚飞蝗无棣种群可能对其它的农药具有较高的抗药性。三、东亚飞蝗有机磷抗性靶标酶生化机制研究本研究分析了东亚飞蝗有机磷靶标乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase,AChE）的生化特性。对东亚飞蝗黄骅种群、黄流种群、无棣种群和敏感品系AChE活性和动力学比较结果表明,三个东亚飞蝗田间种群AChE活性与敏感品系相比有显著差异,黄骅种群、黄流种群和无棣种群AChE活性分别是敏感品系的4.04、9.55和1.99倍,并且三个田间种群的Km值与敏感品系相比也有显著差异;根据有机磷杀虫剂对AChE的体外抑制结果,河北黄骅种群AChE对马拉氧磷、氧化毒死蜱及辛硫磷的敏感性与敏感品系相比分别下降了3.2、2.2和1.1倍。而海南黄流种群对马拉氧磷和氧化毒死蜱的敏感性分别下降了11.3和19.2倍。同时发现,对马拉硫磷生物测定中仅有1.8倍抗药性的山东无棣种群,其AChE对马拉氧磷和氧化毒死蜱的敏感性也分别下降了4.8和2.4倍。结合东亚飞蝗解毒酶的生化机制研究,本文认为黄骅种群对马拉硫磷的抗性机理主要包括酯酶、谷胱甘肽S-转移酶活性升高和乙酰胆碱酯酶的活性升高以及敏感性下降。黄流种群产生抗性主要是由于AChE的活性升高和敏感性降低引起的。而无棣种群可能对其它的农药有较高的抗药性,导致其AChE敏感性的显著下降。据此认为,东亚飞蝗不同种群抗性产生机制是不尽相同的,有可能包括多种不同的抗性机制。四、东亚飞蝗有机磷抗性分子机制研究本研究利用简并性引物和降落PCR技术从东亚飞蝗中克隆获得了3个东亚飞蝗羧酸酯酶（carboxylesterases,CarEs）基因的cDNA片段,分别命名为CarE1,CarE2和CarE3。根据昆虫羧酸酯酶和谷胱甘肽S-转移酶的保守区（motif）,采用生物信息学方法对东亚飞蝗表达序列标签（expressing sequence tags,ESTs）数据库进行了全面搜索,并对其进行了羧酸酯酶和谷胱甘肽S-转移酶ESTs拼接、注释,获得了32条羧酸酯酶ESTs和12条谷胱甘肽S-转移酶ESTs,与克隆获得的3条羧酸酯酶基因片段同源比对和拼接后,共得到34条羧酸酯酶基因片段。采用实时定量PCR技术对上述羧酸酯酶和谷胱甘肽S-转移酶基因在黄骅种群和敏感品系中的表达量进行了比较,结果发现,羧酸酯酶基因CarE1、CarE4、CarE6、CarE12、CarE15、CarE19、CarE22、CarE23、CarE26、CarE27、CarE30和CarE32在黄骅种群中的表达量分别是敏感品系的3.29、1.13、8.78、3.16、3.17、11.84、2.24、4.92、6.24、4.66、4.47和4.73倍;谷胱甘肽S-转移酶基因GST1、GST2、GST3和GST12的表达量分别是敏感品系的1.25、1.33、2.47和1.61倍。据此认为这些羧酸酯酶基因和谷胱甘肽S-转移酶基因表达提高与东亚飞蝗的抗药性密切相关。对东亚飞蝗AChE基因克隆和Western blot分析结果认为直翅目昆虫AChE基因可能有其特殊性,尚有待进一步研究证实。本文通过东亚飞蝗不同种群对有机磷农药的敏感性分析,揭示了东亚飞蝗的田间抗性现状。通过生化和分子生物学方法分析了东亚飞蝗对有机磷的抗性机理,发现东亚飞蝗不同种群在产生抗性过程中的机制是不尽相同的,有可能包括多种不同的抗性机制。这些研究结果对于有效地进行抗性治理,延缓东亚飞蝗的抗性发展均具有重要的实践意义。本文首次借助现有的东亚飞蝗的ESTs数据库对抗性相关解毒酶基因进行了系统研究,用real-time PCR对代谢解毒酶羧酸酯酶基因和谷胱甘肽S-转移酶基因在抗性和敏感种群中差异表达进行了定量分析,确定了抗性形成过程中的关键代谢解毒酶基因,这将极大地推动东亚飞蝗抗性机制的系统深入研究。综上所述,本文研究结果对东亚飞蝗抗性机制和东亚飞蝗的抗性治理均具有重要的理论和实践意义。

论文目录

• 文中部分名词中英文对照及缩略语
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 引言
• 1 本文的研究依据
• 2 本文的研究内容
• 3 本文的目的和意义
• 4 本研究的特色与创新之处
• 第二章 文献综述
• 第一节 东亚飞蝗的国内外研究概况
• 1.1 东亚飞蝗概述
• 1.1.1 东亚飞蝗分布、生活习性和形态特征
• 1.2 东亚飞蝗国内外研究概况
• 1.2.1 国外研究概况
• 1.2.2 国内研究概况
• 第二节 昆虫抗药性的研究进展
• 2.1 昆虫抗药性的定义
• 2.2 昆虫抗药性的分类
• 2.3 昆虫抗药性研究的历史和现状
• 2.4 昆虫抗药性的形成及演化
• 2.5 昆虫抗药性的研究方法和监测技术
• 2.5.1 生物测定法
• 2.5.2 生化测定法
• 2.5.3 电生理检测法
• 2.5.4 抗药性遗传的测定
• 2.5.5 抗药性分子检测
• 2.6 昆虫抗药性生理生化机制
• 2.6.1 昆虫的行为抗性
• 2.6.2 昆虫的生理抗性
• 2.6.3 昆虫的生化抗性
• 2.6.3.1 昆虫的代谢抗性
• 2.6.3.1.1 非专一性酯酶系与抗药性的关系
• 2.6.3.1.2 谷胱甘肽S-转移酶与抗药性的关系
• 2.6.3.1.3 细胞色素P450与抗药性的关系
• 2.6.3.2 昆虫的靶标抗性
• 2.6.3.2.1 乙酰胆碱酯酶靶标与抗性的关系
• 2.6.3.2.2 击倒抗性与钠离子通道
• 2.6.3.2.3 γ—氨基丁酸受体氯离子通道与昆虫抗药性
• 2.7 抗药性治理
• 2.7.1 适度治理
• 2.7.2 饱和治理
• 2.7.3 复合作用治理
• 第三节 我国东亚飞蝗抗药性的研究现状
• 3.1 我国东亚飞蝗的为害
• 3.2 中国东亚飞蝗发生区的生态类型
• 3.2.1 蝗区的概念
• 3.2.2 东亚飞蝗发生区的生态类型
• 3.3 我国东亚飞蝗的治理
• 3.3.1 我国东亚飞蝗治理的发展进程
• 3.3.2 我国东亚飞蝗可持续治理进展
• 3.4 有机磷杀虫剂的毒理作用
• 3.4.1 有机磷杀虫剂的发展及其基本特点
• 3.4.2 有机磷杀虫剂对昆虫毒杀作用的机理
• 3.4.3 有机磷杀虫剂—马拉硫磷的基本特点
• 3.5 东亚飞蝗有机磷抗药性研究
• 3.6 研究展望
• 第三章 东亚飞蝗对有机磷农药的敏感性分析和增效作用测定
• 1 材料与方法
• 1.1 供试东亚飞蝗的采集及饲养
• 1.2 供试药品
• 1.3 生物测定的方法
• 1.4 马拉硫磷增效测定的方法
• 2 结果与分析
• 2.1 东亚飞蝗敏感品系和不同田间种群对有机磷农药的敏感性
• 2.2 东亚飞蝗敏感品系和黄骅种群增效实验结果
• 3 讨论
• 第四章 东亚飞蝗有机磷抗性代谢解毒酶生化机制研究
• 1 材料与方法
• 1.1 供试种群
• 1.2 供试药剂
• 1.3 实验所用的主要仪器设备
• 1.4 酯酶的测定
• 1.4.1 酶液的提取
• 1.4.2 酯酶活性计算的标准曲线的测定
• 1.4.3 酯酶活力的测定
• m、V_max值的测定'>1.4.4 羧酸酯酶动力学常数K_m、V_max值的测定
• 1.4.5 羧酸酯酶的体外抑制
• 1.4.6 酯酶非变性聚丙烯酰胺凝胶（Non-denaturing PAGE）电泳分析
• 1.5 谷胱甘肽S-转移酶活性的测定
• 1.6 细胞色素P450单加氧酶活性的测定
• 1.7 蛋白含量的测定
• 1.8 数据分析
• 2 结果与分析
• 2.1 蛋白浓度测定和酯酶活性计算的标准曲线
• 2.2 东亚飞蝗敏感品系和黄骅抗性种群解毒酶活性的差异
• 2.3 东亚飞蝗黄流和无棣种群羧酸酯酶活性、动力学和体外抑制比较
• 3 讨论
• 3.1 东亚飞蝗黄骅种群代谢解毒机制
• 3.2 东亚飞蝗黄流和无棣田间种群代谢解毒机制
• 第五章 东亚飞蝗有机磷抗性靶标酶生化机制研究
• 1 材料和方法
• 1.1 供试种群
• 1.2 供试药剂
• 1.3 乙酰胆碱酯酶酶液的提取
• 1.4 乙酰胆碱酯酶活性的测定
• m、V_max值的测定'>1.5 乙酰胆碱酯酶动力学常数K_m、V_max值的测定
• 1.6 乙酰胆碱酯酶的体外抑制
• 1.7 乙酰胆碱酯酶非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 1.8 蛋白含量的测定
• 1.9 数据分析
• 2 结果与分析
• 2.1 东亚飞蝗不同种群和敏感品系乙酰胆碱酯酶活性比较
• 2.2 东亚飞蝗不同种群和敏感品系乙酰胆碱酯酶动力学参数比较
• 2.3 东亚飞蝗不同种群和敏感品系乙酰胆碱酯酶对不同抑制剂的敏感性
• 3 讨论
• 第六章 东亚飞蝗有机磷抗性分子机制研究
• 1 材料和方法
• 1.1 供试种群
• 1.2 供试药剂和主要仪器
• 1.3 东亚飞蝗表达序列标签（expressing sequence tags,ESTs）数据库的搜索
• 1.4 东亚飞蝗羧酸酯酶和乙酰胆碱酯酶的基因克隆
• 1.4.1 总RNA提取
• 1.4.2 第一链cDNA合成
• 1.4.3 PCR扩增反应
• 1.4.3.1 PCR引物的设计
• 1.4.3.2 PCR扩增
• 1.4.4 东亚飞蝗羧酸酯酶和乙酰胆碱酯酶PCR产物回收与纯化
• 1.4.5 质粒载体的连接反应和转化
• 1.4.5.1 连接反应
• 1.4.5.2 感受态细胞的制备
• 1.4.5.3 转化反应和细菌培养
• 1.4.6 质粒DNA测序
• 1.4.7 测序及同源性比较
• 1.5 东亚飞蝗乙酰胆碱酯酶的Western blot分析
• 1.5.1 样品的处理
• 1.5.2 SDS-PAGE电泳
• 1.5.3 蛋白质转膜
• 1.5.4 抗体杂交
• 1.6 羧酸酯酶基因3'末端克隆
• 1.6.1 总RNA的提取
• 1.6.2 第一链cDNA合成
• 1.6.3 羧酸酯酶基因的3'-RACE引物
• 1.6.4 3'cDNA末端快速扩增（3'-RACE）
• 1.7 东亚飞蝗羧酸酯酶和谷胱甘肽S-转移酶基因的定量分析
• 1.7.1 总RNA的提取
• 1.7.2 引物设计
• 1.7.3 实时荧光定量PCR反应
• 1.7.4 东亚飞蝗羧酸酯酶和谷胱甘肽S-转移酶基因表达量比较
• 2 结果
• 2.1 东亚飞蝗羧酸酯酶基因PCR扩增cDNA片段的核苷酸顺序及推导的氨基酸顺序
• 2.2 东亚飞蝗羧酸酯酶基因3'RACE扩增片段的核苷酸顺序及推导的氨基酸顺序
• 2.3 序列同源性分析
• 2.4 东亚飞蝗表达序列标签（expressing sequence tags,ESTs）数据库的搜索
• 2.5 荧光定量PCR扩增产物熔解曲线分析
• 2.6 东亚飞蝗羧酸酯酶基因和谷胱甘肽S-转移酶基因相对表达量比较
• 2.7 东亚飞蝗乙酰胆碱酯酶的基因克隆及Western blot分析
• 2.7.1 东亚飞蝗乙酰胆碱酯酶的基因克隆
• 2.7.2 东亚飞蝗乙酰胆碱酯酶Western blot分析
• 2.7.3 东亚飞蝗乙酰胆碱酯酶基因在ESTs数据库中的搜索工作
• 3 讨论
• 3.1 羧酸酯酶的过量表达与东亚飞蝗抗药性的关系
• 3.2 谷胱甘肽S-转移酶的过量表达与东亚飞蝗抗药性的关系
• 3.3 东亚飞蝗乙酰胆碱酯酶基因克隆及其靶标不敏感机制研究
• 全文总结
• 参考文献
• 博士期间发表的学术论文
• 致谢
• 个人简历