论文摘要
背景与目的:异位钙化即非骨组织发生矿物质沉积,主要是钙盐沉积,血管组织钙化是其中的一种,分为中膜钙化和内膜钙化。后者与动脉粥样硬化密切相关,早期参与的细胞主要是巨噬细胞和肥大细胞。硫化氢具有重要的心血管生理与病理作用,本实验拟利用硫氢化钠（Sodium hydrosulfide, NaHS）作为硫化氢的外源性供体,在β-甘油磷酸钠（β-sodium glycerophosphate,β-GP）和氧化低密度脂蛋白（Oxidized low density lipoprotein,oxLDL）诱导的巨噬细胞钙盐沉积的模型上研究外源性硫化氢对巨噬细胞吞噬脂质过程中钙化的影响及其发挥作用的影响因素,为进一步探讨其对内膜钙化的作用提供实验依据。方法:实验1:细胞模型的建立:小鼠单核巨噬细胞用5mmol/L的β-甘油磷酸钠和40mg/mL的oxLDL孵育3天,Von kossa染色形态学观察细胞钙盐沉积,原子吸收分光光度法测定细胞钙含量。实验2:外源性硫化氢对巨噬细胞吞噬脂质过程中细胞钙化的影响（1）不同浓度NaHS对细胞钙化的影响:小鼠单核巨噬细胞在钙化条件培养同时加入不同浓度的NaHS（0,25,50,100,200μmol/L）孵育6天,原子吸收分光光度法测量细胞钙含量,?液闪烁仪检测钙沉积,Western blot检测OPN蛋白和RT-PCR检测OPN mRNA表达。（2）不同时间NaHS处理对细胞钙化的影响:小鼠单核巨噬细胞在钙化条件培养同时加入最佳作用浓度NaHS分别孵育细胞0、2、4、6天（D）。原子吸收分光光度法和?液闪烁仪分别观察细胞钙含量及沉积,Western blot及RT–PCR分别测定OPN蛋白和OPN mRNA表达情况。实验3:外源性硫化氢对细胞钙化作用的影响因素的探讨（1）氧化作用:用400μmol/L过氧化氢刺激细胞内活性氧水平升高,观察活性氧对硫化氢作用的影响,原子吸收分光光度法和?液闪烁仪分别观察细胞钙含量及沉积,Western blot及RT–PCR分别测定OPN蛋白和OPN mRNA表达情况。（2）炎症因子的作用:给予10ng/mL外源性炎症因子白介素-6（Interleukin-6,IL-6）刺激,观察其对硫化氢作用的影响。原子吸收分光光度法和?液闪烁仪分别观察细胞钙含量及沉积,Western blot及RT–PCR分别测定OPN蛋白和OPN mRNA表达情况。结果:1.与正常对照组细胞相比,ox-LDL与β-甘油磷酸钠共孵育的细胞,Von kossa染色后可见细胞内有大量的黑色颗粒沉积,钙含量比正常细胞内高7.7倍（p <0.05）。而单独用ox-LDL或β-甘油磷酸钠孵育细胞,细胞内仅见少量的黑色颗粒沉积。说明巨噬细胞在ox-LDL和甘油磷酸钠共孵育诱导下可明显促进细胞内钙盐积聚沉积。2.与钙化组细胞相比,随着NaHS浓度和作用时间的增加,细胞钙含量和钙沉积逐渐减少,OPN蛋白和mRNA表达也逐渐减少,特别是100μmol/LNaHS作用4D组与未用NaHS（即0μmol/L）组相比,钙含量和钙沉积分别减少6.5倍和7.2倍（p <0.05）,OPN蛋白和mRNA表达也分别减少了5倍和4.8倍（p <0.05）。3.与正常细胞组相比,钙化组细胞内活性氧明显增加,加入H2O2后,NaHS抑制钙盐沉积作用被阻止,细胞钙盐沉积加重,与NaHS处理组相比,OPN mRNA和蛋白表达上升2.9倍和3.1倍（p <0.05）,细胞钙含量和钙沉积增加了6.7倍和7.1倍（p <0.05）。4.钙化细胞炎症因子肿瘤坏死因子-?（TNF-?）产生增多,加入炎症因子白介素-6（IL-6）后,NaHS抑制钙盐沉积作用被阻止,细胞钙化加重。结论:1. ?-甘油磷酸钠和ox-LDL联合应用可成功复制巨噬细胞钙化模型2.外源性硫化氢以浓度和时间依赖性方式缓解巨噬细胞吞噬脂质过程中的钙盐沉积,推测可抑制内膜钙化。3.炎症因子IL-6和氧化作用可阻止外源性硫化氢对巨噬细胞吞噬脂质过程中钙盐沉积的抑制作用。