胀果甘草体细胞染色体加倍的研究及有效成分测定

论文摘要

倍性育种是改良中药材品质,进行中药材育种的有效途径之一。染色体加倍的中药材往往表现出生物学产量、药效成分含量和抗逆性的提高。尽管甘草是一种大宗常用的中药材,用途极其广泛,世界需求量逐年增加,且目前已出现供不应求的局面,但其品质育种进程十分缓慢,至今尚未见报道。为了获得高药效成分含量的甘草品系,本文就甘草体细胞染色体加倍的方法及其次生代谢物进行了研究,并获得了如下结果:1.用秋水仙素浸泡甘草已萌动的种子和干种子,发现0.20%秋水仙素处理萌动种子2 d的萌发率最高,达到93.33%;0.05%秋水仙素处理干种子6 d的萌发率最高,达到76.67%。而0.05%秋水仙素处理萌动种子3d的嵌合率最高,达到34.62%;0.20%秋水仙素处理干种子4d的嵌合率最高,达到27.78%。但秋水仙素处理萌动种子和干种子所获得的平均染色体加倍率没有差异,分别为36.67%、36.48%。2.在秋水仙素结合组织培养加倍法研究中,以下胚轴为外植体,100 mg/L秋水仙素处理24 h、48 h、72 h中,72 h的加倍效果最佳,四倍体频率达到58.75%,而50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L秋水仙素处理24 h中,100 mg/L浓度下的四倍体频率最高,达到51.25%;100 mg/L秋水仙素处理子叶、下胚轴和胚根外植体24 h中,胚根愈伤组织四倍体频率最高,为62.50%。3.甘草离体再生中愈伤组织的诱导较为容易,三种外植体子叶、下胚轴和胚根均以MS+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA为愈伤组织诱导的最佳培养基,在此培养基上,3种外植体愈伤组织诱导率均达到100%。4.甘草愈伤组织的再分化研究中,仅下胚轴外植体形成的愈伤组织获得了再生植株,其频率为4.57%。实验中的最佳分化培养基为MS+3.0 mg/L 6-BA+2.0 mg/L ZT+10.0 mg/L GA3,再生植株的最佳生根培养基为MS+1.0 mg/L IBA+13.5 mg/L KH2PO4。5.甘草组织培养过程中,普遍存在着褐变现象。其中胚根外植体较子叶及下胚轴褐变出现的晚,褐变程度和褐变率低;幼龄下胚轴比老龄下胚轴褐化程度和褐变率低;低无机盐浓度比高无机盐浓度下外植体褐变时间迟,褐变程度低;暗培养能够明显降低愈伤组织的褐变程度和褐变率,比光照培养下降低21.43%;对褐变抑制剂研究的结果表明,Vc的抗褐变效果优于Na2S2O3,培养基中加入0.2 g/L Vc、0.5g/LNa2S2O3的抑制作用最佳;吸附剂AC对褐变无明显抑制作用。6.组织培养加倍法研究中,下胚轴的平均染色体加倍率最高,为46.69%,且子叶、下胚轴和胚根愈伤组织均在1.0 mg/L 2,4-D激素水平下培养40 d的加倍频率最高,分别为66.25%、62.50%和67.50%。2,4-D的加倍效应明显优于NAA及两者组合,平均愈伤组织加倍频率达56.77%,比NAA及两者的组合高15.11%和10.46%,尤其是1.0 mg/L 2,4-D浓度下的愈伤组织四倍体频率最高,为59.79%。愈伤组织培养40d的愈伤组织平均加倍频率比培养20d高,达到43.87%。在获得的46株再生苗中,有2株为四倍体植株。7.不同外植体次生代谢的能力不同,子叶愈伤组织中甘草酸和甘草黄酮的平均含量较高,分别为41.298 mg/g和5.931 mg/g;另外,2,4-D对愈伤组织中甘草酸、甘草黄酮的积累比NAA效果明显,平均含量分别为38.698 mg/g、5.184 mg/g和41.300 mg/g、5.450 mg/g;而1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L 2,4-D组合对愈伤组织中甘草酸、甘草黄酮的积累也具有明显的促进作用。8.不同外植体愈伤组织细胞染色体加倍率与甘草酸和甘草黄酮呈正相关,且相关系数均达到显著水平（r1=0.7663*, r2=0.7643*,r3=0.7789*,r4=0.7809*）,说明细胞倍性变异能够影响甘草酸和甘草黄酮的含量。

论文目录

• 摘要
• SUMMARY
• 引言
• 第一章 文献综述
• 1 植物育种研究进展
• 1.1 引种
• 1.2 选择育种
• 1.3 杂交育种
• 1.4 诱变育种
• 1.5 杂种优势利用
• 1.6 基因工程育种
• 1.7 细胞工程育种
• 2 植物倍性育种
• 2.1 单倍体育种
• 2.1.1 孤雌生殖法诱导单倍体
• 2.1.2 花药培养法诱导单倍体
• 2.1.3 花粉培养法诱导单倍体
• 2.2 多倍体育种
• 2.2.1 多倍体育种的意义
• 2.2.2 多倍体育种的途径
• 2.2.3 多倍体的鉴定方法
• 3 药用植物多倍体育种研究进展
• 3.1 多倍体在中药材生产上的优势
• 3.1.1 生物产量提高
• 3.1.2 抗逆性增强
• 3.1.3 药用活性成分变化
• 3.2 药用植物人工诱导多倍体的趋势
• 3.2.1 多倍体诱导成为药用植物育种的主要途径
• 3.2.2 组织培养结合秋水仙素的诱导方式
• 4 药用植物组织培养中控制褐变的研究
• 4.1 褐变的原因
• 4.1.1 基因型
• 4.1.2 外植体的种类、大小和生理状态
• 4.1.3 培养条件及培养基的成分
• 4.2 防止褐变的措施
• 4.2.1 选择适宜的外植体和培养条件
• 4.2.2 培养基中加入抗氧化剂
• 4.2.3 培养基中加入吸附剂
• 5 药用植物组织培养中次生代谢物生产
• 6 本研究的目的意义
• 第二章 甘草染色体加倍的技术体系研究
• 1 试验材料
• 2 试验方法
• 2.1 秋水仙素浸种的染色体加倍法
• 2.1.1 秋水仙素浸泡干种子
• 2.1.2 秋水仙素浸泡萌动种子
• 2.2 组织培养加倍法
• 2.2.1 无菌实生苗的获得
• 2.2.2 愈伤组织诱导及细胞倍性检查
• 2.2.3 再生苗分化
• 2.2.4 愈伤组织褐变的抑制
• 2.3 秋水仙素结合组织培养加倍法
• 2.4 倍性鉴定
• 2.4.1 溶液配制
• 2.4.2 染色体数目观察
• 3 试验结果与分析
• 3.1 秋水仙素处理甘草种子的染色体加倍方法研究
• 3.1.1 不同浓度的秋水仙素和不同处理时间对甘草种子萌发率的影响
• 3.1.2 不同浓度的秋水仙素和不同处理时间对甘草种子染色体加倍率的影响
• 3.1.3 秋水仙素处理干种子及萌动种子的染色体加倍频率的比较
• 3.1.4 染色体倍性的嵌合表现
• 3.2 甘草组织培养染色体加倍方法的研究
• 3.2.1 甘草愈伤组织培养
• 3.2.2 甘草愈伤组织的再分化体系建立
• 3.2.3 甘草愈伤组织培养过程中体细胞的染色体倍性变化
• 3.2.4 甘草再生植株的染色体倍性变化
• 3.3 秋水仙素结合组织培养的染色体加倍方法研究
• 3.3.1 秋水仙素浓度对愈伤组织染色体加倍的影响
• 3.3.2 秋水仙素处理时间对愈伤组织染色体加倍的影响
• 3.3.3 秋水仙素作用下不同外植体染色体加倍效果的比较
• 3.4 讨论
• 第三章 染色体加倍过程中甘草愈伤组织有效成分含量测定
• 1 试验仪器和药品
• 2 试验方法
• 2.1 培养方法
• 2.2 甘草酸与甘草黄酮的联合提取
• 2.3 标准曲线的制备
• 2.3.1 甘草酸标准曲线的制备
• 2.3.2 柚皮苷标准曲线的制备
• 2.4 样品含量测定
• 2.4.1 甘草黄酮含量测定
• 2.4.2 甘草酸含量测定
• 2.5 重现性试验
• 3 试验结果与分析
• 3.1 线性关系考察结果
• 3.2 重现性试验结果
• 3.3 样品中甘草酸和甘草黄酮的含量
• 3.3.1 不同外植体愈伤组织中甘草酸和甘草黄酮含量的比较
• 3.3.2 不同激素浓度组合对愈伤组织中甘草酸和甘草黄酮含量的影响
• 4 讨论
• 结论
• 附图
• 附图说明
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介
• 导师简介