黄牛脂联素基因遗传特性及在大肠杆菌中的表达研究

论文摘要

本研究采用PCR-SSCP和DNA测序技术,检测了南阳牛、秦川牛、郏县红牛、晋南牛、中国荷斯坦牛5个群体的脂联素基因（Acrp30）的遗传变异,分析了其遗传结构和遗传多样性,并对南阳牛、秦川牛和郏县红牛3个群体该基因的多态基因座与其生长性状进行了关联分析,以检验该基因的多态基因型对3个黄牛群体生长发育的遗传效应,以期发现对重要经济性状具有显著效应的遗传标记,为中国黄牛的高效选育和分子标记数据库的建立、种质资源保存与利用提供遗传学依据。此外,对秦川牛脂联素基因进行了体外克隆、表达研究,为进一步的功能研究奠定了基础。本研究获得了以下结果:1.脂联素基因多态性及其与南阳牛、秦川牛、郏县红牛生长性状的关联分析共研究了5个群体的6个基因座。在内含子2新发现2个SNP（+822 C>T和+866 C>T,以起始密码子ATG中的A作为+1来定义序列的相对位置,下同）,3’侧翼区新发现1个SNP。5个牛群体Hardy-Weinberg平衡检验结果表明,内含子2上的SNP位点处于非平衡状态。多态信息含量分析结果表明,除内含子2（+822 C>T）为中度多态外,其它位点均为低度多态。基因型分布的卡方独立性检验显示,在内含子2基因型分布差异比较大,各品种间均差异极显著（P<0.01）,3’侧翼区基因型分布在各品种间差异均不显著（P<0.05）。在编码区未发现SNP。利用最小二乘拟合线性模型,对内含子2和3’侧翼区多态位点不同基因型与黄牛部分经济性状进行显著性检验,结果表明,不同基因型与南阳牛、秦川牛和郏县红牛3个群体的经济性状无显著关联。2.脂联素基因启动子区多态性及其序列分析在启动子区3个基因座中,在P1基因座（-9862--10333）新发现5个点突变（-10241 G>T、-10171 C>T、-10007 G>C、-9886 C>T、-9936 C>G）以及1处插入突变（-9940-9939 ins 67bp）。在P3基因座（-10598--11080）新发现1个点突变（-10997 C>T）以及1处缺失突变（-10744--10740 delGATTA）。对P1和P3基因座的插入和缺失基因型分布的卡方独立性检验显示,奶牛与检测的地方黄牛存在显著差异（P<0.05）,但各群体在两个位点的PIC均小于0.20。通过对启动子区的转录因子结合位点的分析发现,在P1基因座存在一个固醇调节元件相关蛋白（SREBP）结合位点,两个过氧化物酶体增殖物活化受体（PPAR）的结合位点以及一个碳水化合物反应元件（ChRE）。在P3基因座存在两个增强子结合蛋白（C/EBP）的结合位点及过氧化物酶体增殖物活化受体（PPAR）的结合位点。通过序列分析发现,P1位点的插入序列实际上造成了一个可变拷贝,在这个插入序列中包含了一个碳水化合物反应元件（ChRE）,而P3位点的缺失突变则导致一个增强子结合蛋白（C/EBP）结合位点的产生。3秦川牛脂联素基因的克隆、表达本试验利用Overlap-PCR技术首次扩增获得秦川牛脂联素基因全长CDS序列。脂联素基因编码区全长为723 bp,与GenBank公布序列的同源性为100%。将得到的脂联素基因CDS区导入到pET32a（+）表达载体骨架上,构建了脂联素基因大肠杆菌高效表达载体pAcrp-32,并得到了His-Acrp融合蛋白,大小为44kD（a包含表达的标签蛋白）。可溶性分析该融合蛋白以包涵体形式存在。并利用his-trap亲和层析柱对脂联素融合蛋白进行了纯化,为进一步的功能研究打下了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 文献综述
• 1.1 脂联素基因研究进展
• 1.1.1 脂联素的发现及其存在形式
• 1.1.2 脂联素受体
• 1.1.3 脂联素基因表达与调控
• 1.1.4 脂联素对糖和脂肪代谢的调控作用
• 1.1.5 脂联素主要生物学功能
• 1.1.6 脂联素基因的结构及其变异
• 1.2 家畜分子遗传标记技术
• 1.2.1 SNP 作为遗传标记的优势
• 1.2.2 SNP 检测方法
• 1.3 重组PCR 技术的发展及应用
• 1.3.1 重组PCR 技术的创立和发展
• 1.3.2 重组PCR 技术的用途
• 1.3.3 Overlap PCR 技术
• 1.4 大肠杆菌体外高效表达系统研究进展
• 1.5 研究目的、意义和内容
• 第二章 脂联素基因遗传多样性研究
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 试验动物样本来源
• 2.1.2 试验数据的收集
• 2.1.3 试验主要试剂
• 2.1.4 仪器设备
• 2.1.5 主要试剂和溶液的配制
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 血样的采集
• 2.2.2 牛全血基因组DNA 的提取
• 2.2.3 PCR 反应所用引物的设计
• 2.2.4 DNA 质量的检测、纯化及浓度计算
• 2.2.5 样品的PCR 扩增
• 2.2.6 扩增产物的PCR-SSCP 检测
• 2.2.7 图像分析
• 2.2.8 测序
• 2.3 资料的统计与分析
• 2.3.1 基因频率和基因型频率的计算
• 2 独立性检验）'>2.3.2 基因频率和基因型频率的差异显著性检验（χ²独立性检验）
• 2.3.3 位点遗传纯合度（Ho）、杂合度（He）和有效等位基因数（Ne）
• 2.3.4 多态信息含量（polymorphism information content，PIC）
• 2.3.5 关联分析统计模型
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 牛基因组DNA 样品的检测
• 2.4.2 脂联素基因多态性检测
• 2.4.3 脂联素基因启动子区多态性检测
• 2.4.4 脂联素基因启动子区插入缺失检测
• 2.5 脂联素基因多态基因座的群体遗传学分析
• 2.5.1 I3 基因座
• 2.5.2 3-U 基因座
• 2.5.3 P1 基因座插入突变位点
• 2.5.4 P3 基因座缺失突变位点
• 2.6 脂联素基因启动子区P1 和P3 基因座转录因子结合位点预测与插入缺失序列分析
• 2.7 脂联素基因单倍型分析
• 2.8 脂联素基因多态基因座与秦川牛、南阳牛和郏县红牛生长性状的关联分析
• 2.8.1 I3 多态基因座与生长性状的关联分析
• 2.8.2 3-U 多态基因座与生长性状的关联分析
• 2.8.3 P1 基因座插入突变位点与生长性状的关联分析
• 2.8.4 P3 基因座缺失突变位点与生长性状的关联分析
• 第三章 脂联素基因的克隆及在大肠杆菌中的表达
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 Overlap-PCR 扩增脂联素基因CDS 区
• 3.2.2 脂联素基因大肠杆菌表达载体pAcrp-32 的构建与鉴定
• 3.2.3 重组蛋白的表达与可溶性分析
• 3.2.4 目的蛋白的大量表达和纯化
• 第四章 讨论
• 4.1 关于本研究中的突变与N.S.Morsci 研究中的突变的讨论
• 4.1.1 突变检测序列的选择
• 4.1.2 突变位点的位置比较
• 4.1.3 脂联素基因的保守性分析
• 4.2 关于Intron2 的突变位点的讨论
• 4.3 关于3-UTR 的突变位点的讨论
• 4.4 关于启动子区的突变位点的讨论
• 4.4.1 关于P1 基因座的插入突变的讨论
• 4.4.2 关于P3 基因座的缺失突变的讨论
• 4.5 关于启动子区的转录因子结合位点的讨论
• 4.5.1 关于预测的转录因子的功能的讨论
• 4.5.2 关于插入和缺失的序列的讨论及其对启动子活性的影响
• 4.6 关于脂联素基因多态性及其与生长性状的关联性的讨论
• 4.7 关于Overlap-PCR 克隆基因的讨论
• 4.8 关于脂联素基因在大肠杆菌中的表达的讨论
• 第五章 结论与创新点
• 5.1 结论
• 5.2 创新点
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介