基于微针给药的靶向黑素细胞抗色素沉着纳米粒的研究

论文摘要

色素沉着造成的皮肤色斑影响了患者的生活质量,却尚未有理想的治疗方法。正常皮肤颜色主要由皮肤中黑素含量决定。黑素来源于黑素细胞,黑素细胞位于表皮基底层,是皮肤中黑素合成的场所。黑素生成的生化过程:存在于黑色素细胞中的酪氨酸在酪氨酸酶、多巴色素互变酶、DHICA氧化酶作用下经多巴、多巴醌、多巴色素、二羟基吲哚等中间体逐步转化成为真黑色素,在此过程中酪氨酸酶是黑素生成的起始限速酶,是黑素生成最重要的环节。皮肤中的激素:促黑素细胞激素（α-MSH）和促肾上腺皮质激素（ACTH）可以和黑素细胞膜表面的黑皮素-1受体（MC1R）结合,通过信号转导使细胞内酪氨酸酶活性增加,黑素细胞增殖加快,从而黑素含量增加。当皮肤受到紫外线照射、炎症刺激时,局部黑素单位的微环境发生变化,激素类与受体结合增加,合成黑素增多或细胞增殖加快,局部皮肤中出现色素沉着,造成肤色不均匀。目前抗色素沉着药物以抑制酪氨酸酶活性药物为主。本课题通过构建以刺鼠蛋白（ASIP）为靶向头基的熊果苷（Arbutin）纳米粒（NPs）,由ASIP和熊果苷产生双重抗色素沉着的作用。通过微针作用于色斑部位皮肤,促进纳米粒的经皮递送,并具有初步定位作用（皮层定位）,纳米粒进入皮肤后可以通过ASIP特异性地结合黑素细胞表面的黑皮素1受体MC1R,产生再次定位（细胞定位）。因此基于微针给药的ASIP修饰的载熊果苷纳米粒具有双重定位,双重抗色素沉着作用。在体外实验中,ASIP修饰的载熊果苷纳米粒显示出对黑素细胞具有良好的靶向性和抗黑色生成效果。在体内实验中,经微针作用后,与熊果苷单一药物相比,显示出更加显著的抗色素沉着效果。通过制备双荧光纳米粒研究基于微针给药的纳米粒经皮递送机理。采用共聚焦显微镜对纳米粒经微针给药后的皮肤进行断层扫面,结果显示纳米粒经由微针作用皮肤后产生的微孔渗透进入皮肤;通过HPLC法测定皮肤及接收液中纳米粒的分布,结果显示48h后没有纳米粒进入接收液;但微针可以显著增加纳米粒在皮肤内的滞留量,并且纳米粒在表皮层中的滞留量大于真皮层;降低纳米粒粒径均可以增加纳米粒皮肤滞留量。与裸鼠皮肤相比,微针对于人体皮肤中纳米粒的促透效果更加明显。经体外黑素细胞培养实验,以药效和安全性综合评价,优选美白药物。结果表明熊果苷抑制酪氨酸酶活性和抑制黑素生成的效果较好,且其安全性最好。将熊果苷作为抗色素沉着的模型药物制备纳米粒,经正交实验优选纳米粒制备工艺,所制备的载熊果苷PLGA纳米粒粒径在200nm以内,Zeta电位-30mv以上,能够形成稳定胶体溶液,扫描电镜观察其外观圆整,大小均一,分散性好。采用在EDC和NHS的偶联将ASIP共价结合于熊果苷纳米粒表面,实现靶向于黑素细胞MC1R受体的主动靶向纳米粒的构建。所构建的纳米粒形态圆整,分散均匀,未发生粘连聚集等现象,说明靶向纳米粒性质稳定。采用PE标记ASIP,在流式细胞仪和共聚焦显微镜下观察,证实ASIP已连接于纳米粒的表面。通过体外细胞实验,以共聚焦显微镜观测靶向纳米粒与靶细胞的内吞过程,10min时靶向纳米粒已能够识别并吸附于黑素细胞表面,2h时已大量进入细胞浆;通过流式细胞仪检测证实靶向纳米粒对于具有MC1R受体的黑素细胞靶向性能良好。体外药效实验证实以ASIP修饰纳米粒后,可以与黑素细胞MC1R受体特异性结合,并且可以拮抗α-MSH的与受体的结合,同时可以抑制由α-MSH引起的酪氨酸酶活性增强、黑素合成增加以及黑素细胞增殖。而且在酪氨酸酶活性抑制、黑素合成抑制方面,Arbutin-NPs-ASIP效果优于单一Arbutin或ASIP的效果。采用中波紫外线照射C57BL小鼠皮肤,建立皮肤色素沉着模型,通过对照组和实验组的皮肤亮度变化、皮肤内黑素细胞增殖和皮肤内黑素颗粒量的比较,说明靶向纳米粒具有ASIP和Arbutin双重抗色素沉着的效果,且效果优于单一给药组。且该靶向纳米粒对皮肤无刺激性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一部分 基于微针给药的纳米粒经皮递送机理研究
• 1 仪器与材料
• 1.1 仪器
• 1.2 材料与试剂
• 2 微针对纳米粒经皮给药的促透作用研究
• 2.1 双荧光纳米粒的制备和表征
• 2.2 香豆素-6 HPLC 分析方法的建立
• 2.3 包封率和载药量测定
• 2.4 纳米粒体外释放实验
• 2.5 离体皮肤的制备
• 2.6 微针阵列处理皮肤
• 2.7 皮肤样品测定方法的建立
• 2.8 透皮实验
• 2.9 结果
• 3 纳米粒特性对微针经皮给药的影响
• 3.1 纳米粒的制备和表征
• 3.2 纳米粒经皮给药
• 3.3 结果
• 4 人体皮肤中纳米粒经微针给药的经皮递送
• 4.1 皮肤的预处理
• 4.2 透皮实验
• 4.3 结果
• 5 小结
• 6 讨论
• 参考文献
• 第二部分 抗色素沉着药物的优选及载药PLGA 缓释纳米粒的制备表征
• 1 仪器与材料
• 1.1 仪器
• 1.2 材料与试剂
• 2 实验方法
• 2.1 抗色素沉着药物的优选
• 2.2 熊果苷纳米粒制备及表征
• 2.3 熊果苷HPLC 分析方法的建立
• 2.4 包封率的测定
• 2.5 载药量的测定
• 2.6 体外释放试验
• 3 实验结果
• 3.1 美白剂对细胞内酪氨酸酶活性抑制作用
• 3.2 美白剂对黑素生成的影响
• 3.3 美白剂对细胞增殖的影响
• 3.4 药效及安全性评价
• 3.5 熊果苷含量测定方法学结果
• 3.6 纳米粒中熊果苷的测定
• 3.7 载熊果苷纳米粒的制备工艺优化
• 3.8 体外释放实验
• 4 小结
• 5 讨论
• 参考文献
• 第三部分 靶向纳米粒的构建及体外靶向性评价
• 1 仪器与材料
• 1.1 仪器
• 1.2 材料与试剂
• 2 实验方法
• 2.1 小鼠ASIP 的重组和构建
• 2.2 ASIP 修饰的靶向纳米粒的构建
• 2.3 ASIP 接枝率的测定
• 2.4 靶向纳米粒的粒径分布与Zeta 电位
• 2.5 靶向纳米粒的表面形态测定
• 2.6 验证ASIP 与纳米粒偶联
• 2.7 靶向纳米粒的体外生物功能评价实验
• 3 结果
• 3.1 BCA 含量测定试剂盒标准曲线
• 3.2 BCA 含量测定方法的回收率和精密度测定
• 3.3 纳米粒上偶联的ASIP 的定量测定
• 3.4 纳米粒的形态与表征
• 3.5 流式细胞仪定性验证纳米粒偶联
• 3.6 共聚焦显微镜定性验证实验
• 3.7 靶向纳米粒的细胞内吞
• 3.8 流式细胞仪验证ASIP 的生物活性
• 4 小结
• 5 讨论
• 参考文献
• 第四部分 靶向纳米粒的体外药效研究
• 1 仪器与材料
• 1.1 仪器
• 1.2 材料与试剂
• 2 实验方法
• 2.1 ASIP 修饰纳米粒对细胞MC1R 受体的结合及对α-MSH 的拮抗作用
• 2.2 体外药效评价
• 3 实验结果
• 3.1 ASIP 修饰纳米粒对细胞 MC1R 受体的结合及对α-MSH 的拮抗 作用
• 3.2 体外药效评价
• 4 小结
• 5 讨论
• 参考文献
• 第五部分 刺鼠蛋白修饰载熊果苷纳米粒的体内药效评价
• 1 仪器与材料
• 1.1 仪器
• 1.2 材料与试剂
• 1.3 实验动物
• 2. 实验方法
• 2.1 色素沉着小鼠模型
• 2.2 皮肤亮度测定
• 2.3 Dopa 染色法-皮肤中黑素细胞染色
• 2.4 Masson Fontana 染色法-皮肤中黑素颗粒染色
• 2.5 统计分析
• 2.6 统计分析
• 3 实验结果
• 3.1 色素沉着小鼠模型
• 3.2 皮肤亮度变化
• 3.3 Dopa 染色法-皮肤中黑素细胞染色
• 3.4 皮肤中黑素颗粒染色
• 3.5 皮肤刺激性实验评价指标与结果
• 4 小结
• 5 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 综述:美白化合物的分类和筛选评价方法
• 1 美白化合物的筛选
• 1.1 酶测定和细胞的培养方法
• 1.2 重建人体表皮
• 1.3 动物模型
• 2 美白化合物的效能评价
• 2.1 体内人体试验
• 2.2 临床评估
• 2.3 仪器评价
• 2.4 分析方法
• 2.5 适用性测试
• 3 美白化合物分类
• 3.1 氢醌
• 3.2 对苄氧酚
• 3.3 对甲氧酚
• 3.4 熊果苷
• 3.5 皮质激素
• 3.6 维甲酸
• 3.7 壬二酸
• 3.8 曲酸
• 3.9 维 C 磷酸酯镁
• 3.10 烟酰胺
• 3.11 丁基间苯二酚
• 3.12 丝氨酸蛋白酶抑制剂
• 3.12 羟基酸
• 3.13 鞣花酸
• 3.14 白藜芦醇
• 3.15 甘草提取物
• 3.16 亚油酸和硫辛酸
• 参考文献
• 发表论文及参加的科研工作
• 致谢