MDV部分流行株致病基因分析及疫苗免疫保护评价

论文摘要

马立克氏病（MD）是鸡的一种高度传染性、淋巴组织增生性疾病。该病广泛流行,是一种严重危害家禽的传染病。该病的致病因子为马立克氏病病毒（MDV）,属α-疱疹病毒,包括1、2、3三种血清型（MDV1;MDV2;HVT）,3种血清型病毒间存在血清学交叉反应。MDV基因组庞大,由多类功能基因组成。其中致病基因包括:1)与致病性直接相关的基因;2)与致病性间接相关的基因;3)致病辅助性基因。它们在不同毒力MDV毒株之间存在差异,这些差异与致病性具有一定相关性,对MDV的致病机制研究具有重要的作用。其中Meq基因作为致病直接相关基因,和MDV肿瘤的形成是直接相关的;132bp重复序列是MDV-1所独有的,其在病毒基因组中拷贝数的多少可能与致病性相关;RLORF-4基因是致病间接相关基因,间接参与致病的调控。MDV的致病机理比较复杂,病毒在体内的复制情况也不是很清楚。通过对我国五省分离的MDV毒株的致病相关基因分析及分离病毒在体内复制的研究,对MDV在我国的发生、流行及防控具有重要意义。本研究根据已发表的MDV GA株基因组序列,分别设计Meq基因、RLORF-4基因及132bp重复序列的特异性引物,通过PCR方法分别扩增近两年从我国5个省分离毒株相应基因片段。将扩增的Meq基因及RLORF-4基因特异片段分别克隆入T载体,进行序列测定和比较分析。通过琼脂糖电泳分析不同毒株基因组中132bp重复序列的拷贝数。并对其中三株分离毒株分别进行致病性试验。通过HVT单价疫苗和HVT+SB-Ⅰ双价疫苗对分离毒株的免疫保护作用,分析毒株的致病性。应用琼脂糖凝胶沉淀试验（AGP）及常规PCR方法对试验鸡进行检测。同时运用荧光定量PCR方法,对这些羽髓中的病毒载量进行定量检测,确定病毒在体内的复制情况,研究病毒在体内的增值规律。对国内分离毒株Meq基因、RLORF-4基因序列、132bp重复序列的拷贝数的比较,以及分离毒株的致病性、体内增值规律的研究表明:Meq基因作为MDV致病直接相关基因,不同毒株的氨基酸序列存在突变,这些突变和病毒的毒力存在一定的相关性,其中两点突变是国内流行毒株所独有的;RLORF4基因作为可能和致病相关的基因,一级结构序列未发现有意义的突变,强弱毒株之间变异不大;分离毒株的132bp重复序列拷贝数都是2个,符合MDV1强毒株的特点。我们也发现疫苗株814的132bp重复序列拷贝数为2个,这说明用132bp重复序列拷贝数的多少来区分强弱毒株存在例外情况。在3株分离毒株的致病性试验中,感染鸡的MD发病率在7194%之间,而HVT单价疫苗及双价疫苗免疫的鸡只中仍可引起1841%和1833 %的发病率,表明这3株MDV的毒力介于强毒（vMDV）和超强毒（vvMDV）之间。应用实时荧光定量PCR法检测3株分离株在鸡羽髓中的动态变化规律,发现与传统MDV强毒株相比,分离毒株在鸡体内有较高的复制能力,并且病毒滴度的峰值来临的更早,二次溶细胞感染发生的更加显著,是MDV流行毒株一个新的特点。通过对MD国内流行毒株致病相关基因及病毒在体内增值的研究,确定了毒株致病直接相关基因的变化同毒株的致病性及病毒在体内的增值存在一定相关性,更确切的致病相关机制还有待进一步证明。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 鸡马立克氏病及鸡马立克氏病病毒概述
• 1.2 马立克氏病病毒基因组
• 1.2.1 马立克氏病病毒基因组结构
• 1.2.2 鸡马立克氏病致病基因
• 1.3 马立克氏病病毒致病机理
• 1.3.1 早期溶细胞感染
• 1.3.2 潜伏感染
• 1.3.3 第二次溶细胞感染
• 1.3.4 转化
• 1.4 流行病学
• 1.5 马立克氏病病毒的分离检测方法
• 1.5.1 病毒的分离
• 1.5.2 病毒的检测方法
• 1.6 研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 病毒
• 2.2 SPF 鸡胚、SPF 雏鸡
• 2.3 载体与受体菌
• 2.4 主要试剂
• 2.5 主要仪器设备
• 2.6 引物
• 2.7 MDV 致病基因的研究
• 2.7.1 鸡胚成纤维细胞的制备
• 2.7.2 病毒培养
• 2.7.3 病毒基因组总DNA 提取
• 2.7.4 致病基因的PCR 扩增
• 2.7.5 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.7.6 PCR 产物的纯化回收
• 2.7.7 PCR 产物的连接与转化
• 2.7.8 碱裂解法提取质粒
• 2.7.9 重组质粒的鉴定
• 2.7.10 Meq、RLORF-4 基因序列的测序与分析
• 2.8 3 株分离毒株的致病性试验
• 2.8.1 免疫
• 2.8.2 攻毒
• 2.8.3 AGP 试验和PCR 方法检测试验样本
• 2.9 3 株分离毒株病毒体内增值试验
• 2.9.1 荧光定量PCR阳性标准品的制备
• 2.9.2 荧光定量PCR标准品曲线的构建
• 2.9.3 荧光定量PCR检测试验样品
• 2.9.4 病毒体内增值分析
• 3 结果
• 3.1 MDV 致病基因的分析
• 3.1.1 病毒基因组总DNA
• 3.1.2 Meq 基因的扩增
• 3.1.3 RLORF-4 基因扩增
• 3.1.4 132bp 重复序列的扩增
• 3.1.5 重组质粒的鉴定
• 3.1.6 Meq 基因的测序
• 3.1.7 RLORF-4 基因的测序
• 3.1.8 分离毒株 132bp 重复序列拷贝数
• 3.2 3 株分离毒株的致病性试验
• 3.2.1 AGP 试验和PCR 方法检测样本结果
• 3.2.2 免疫攻毒和致病力试验结果
• 3.3 3 株分离毒株病毒体内增值分析
• 3.3.1 Meq 基因及Ovo 基因PCR 扩增
• 3.3.2 Meq 基因及Ovo 基因鉴定
• 3.3.3 荧光定量PCR 标准曲线构建
• 3.3.4 荧光定量PCR 对分离毒株的检测分析
• 4 讨论
• 4.1 MDV 致病基因的研究
• 4.2 3 株分离毒株的致病性
• 4.3 3 株分离毒株病毒体内增值分析
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文