论文摘要
十字花科（Brassicaceae）植物中,芸薹属（Brassica）和拟南芥（Arabidopsis thaliana）是两个重要的模式体系。拟南芥为重要的模式植物,而芸薹属则包括白菜（Brassica rapa）、甘蓝（Brassica oleracea）和甘蓝型油菜（Brassica napus）等诸多重要的经济作物。拟南芥与芸薹属起源于同一祖先,亲缘关系较近,它们的基因序列一致性较高,我们可以参考拟南芥基因组信息对芸薹属的重要功能基因进行分析。早在20世纪20—30年代通过细胞学研究,发现芸薹属包含白菜（B.rapa,AA,2n=20）、黑芥（B.nigra,BB,2n=16）和甘蓝（B.oleracea,CC,2n=18）3 个基本种和芥菜型油菜（B.juncea,AABB,2n=36）、甘蓝型油菜（B.napus,AACC,2n=38）、埃塞俄比亚芥（B.carinata,BBCC,2n=34）3个复合种,基本种间的两两杂交形成了异源四倍体复合种。禹氏三角（U’striangle）在芸薹属异源多倍体及其祖先二倍体之间关系的研究上已获得认可。同时,也为甘蓝型油菜是由白菜和甘蓝通过天然种间杂交形成这一理论提供了证据。另外,拟南芥与芸薹属比较基因组学研究表明,芸薹属祖先在基因组水平曾发生过三倍化。植物体中,促分裂原活化蛋白质激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）是丝/苏氨酸蛋白质激酶中的一个大家族,而MAPK级联途径主要由MAPK、MKK（MAPKK）和MEKK（MAPKKK）3个部分组成,通过蛋白质磷酸化作用将上游信号级联放大传递至下游应答分子（MEKK→MKK→MAPK）,它在植物体响应外界信号、调节生长发育和抗逆等生理过程中起重要作用。本研究利用RACE技术,克隆了甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝MAPK1、MAPK2和MAPK7家族（MAPK C组基因家族）主要成员的全长cDNA和基因组序列,通过生物信息学分析为这3个物种间以及它们与拟南芥间的关系提供了比较基因组学的证据,也揭示了芸薹属MAPK C组基因家族一些重要的分子进化特征。另外,通过生物、非生物诱导和转基因手段对甘蓝型油菜MAPK1的功能进行了鉴定,主要研究结果如下:1、克隆了芸臺属MAPKC组基因家族主要成员。利用RACE同源克隆技术,从甘蓝型油菜、白菜和甘蓝中分离出MAPK1和MAPK2均为 2、1、1个,命名为 BnMAPK1-1、BnMAPK1-2、BrMAPK1、BoMAPK1和 BnMAPK2-1、BnMAPK2-2、BrMAPK2、BoMAPK2;分离出 MAPK7 为 2、2 和1个,命名为 BnMAPK7-1、BnMAPK7-2、BrMAPK7-1、BrMAPK7-2 和 BoMAPK7。在芸薹属物种甘蓝型油菜、白菜和甘蓝中没有分离出与拟南芥AtMAPK14垂直同源的基因。种内每个基因成员的cDNA与对应的gDNA之间基本一致,区别主要在于内含子区的有无。在芸薹属MAPKC组基因家族的5’UTR区域,具有一段长度极其不保守的"TC"重复序列,推测这段"TC"重复序列很可能是调控位点之一。同时,芸薹属MAPKC组基因家族的UTR区域存在一定的多态性,一个ORF两端可能具有多个UTR形式,这可能也是MAPK基因调节的形式之一。大部分芸薹属MAPK C组基因家族的成员具有可变转录起始位点和多个poly（A）加尾位点。除 MAPK7,它们的3’UTR 中也存在 AATAA、AAATAA、AAATATAA、AAATAATAA等加尾信号。2、明确了芸薹属C组MAPK基因家族各成员之间的进化关系通过对芸薹属和拟南芥等植物MAPK C组基因家族的系统进化分析,发现在芸薹属 MAPK C1（MAPK1 和 MAPK2）位点上,BnMAPK1-1 和 BnMAPK2-1 来自基本种白菜,BnMAPK1-2和BnMAPK2-2来自基本种甘蓝。在芸薹属MAPKC1位点上,甘蓝型油菜等于白菜与甘蓝之和。在芸薹属MAPK C2（MAPK7）位点上,BnMAPK7-1 来自 BrMAPK7-1,而 BnMAPK7-2 来自 BoMAPK7。同时,在系统进化上,BnMAPK7-2 和 BoMAPK7 离 BrMAPK7-2 较近,而离 BrMAPK7-1 较远。并且发现BnMAPK7-2、BoMAPK7和BrMAPK7-2与拟南芥AtMAPK7亲缘关系较近,而与BnMAPK7-1和BrMAPK7-1亲缘关系较远,这可能是芸薹属祖先中的1个MAPK7在芸薹属与拟南芥属分开后加倍的过程中,一些成员比较保守地保留了下来（如BrMAPK7-2,BoMAPK7的祖先）,而另外一些发生了较大的变化（如BrMAPK7-1的祖先）。因此,在白菜和甘蓝天然杂交形成的甘蓝型油菜中同时存在比较保守的成员（BnMAPK7-2）和变化较大的成员（BnMAPK7-1）。甘蓝型油菜在MAPK7位点上与MAPK C1位点相同,也等于白菜与甘蓝之和。3、甘蓝型油菜MAPK1可能参与多种信号途径从甘蓝型油菜中克隆了MAPK 的启动子序列,分析发现它含有多个激素响应元件和逆境胁迫响应元件。对甘蓝型油菜MAPK1在损伤和病原菌胁迫下的表达模式分析,发现植物激素茉莉酸甲酯（MeJA）、水杨酸（SA）、脱落酸（ABA）和过氧化氢（H2O2）,及损伤（wound）和核盘菌（sclerotinia sclerotiorum）均能在转录水平上激活BnMAPK1,说明BnMAPK1可能在与植物激素（MeJA、SA、ABA）、信号分子（H202）相关的多种信号途径中起作用,并在抵抗外界多种胁迫（损伤,病原菌）中起作用。另外,]A信号途径在甘蓝型油菜响应损伤和病原菌入侵过程中可能起主导作用,且]A信号途径和SA信号途径相互抑制。4、获得超量表达BnMAPK1的甘蓝型油菜通过农杆菌介导的下胚轴侵染法,将构建的BnMAPK1家族超量表达载体转入甘蓝型油菜中油821 DH系,获得12株转基因阳性植株。qRT-PCR检测结果表明,所有T0代植株中BnMAPK1的表达水平均高于对照植株,最高约为WT的13倍,最低约为2倍。5、甘蓝型油菜MAPK1参与植株的生长发育在转基因阳性株系中,植株各个时期生物量的积累均比对照植株高。通过对叶片表面观察,发现芯芽叶中转基因植株的叶片表面细胞明显比对照植株多,而成熟叶中转基因植株的叶片表面细胞明显比对照植株大,说明BnMAPK1可能与植株的生长发育和细胞分裂相关,其表达量的提高在植株生长过程中起促进作用。6、甘蓝型油菜MAPK1在植株响应病原菌中起作用叶片离体接种核盘菌的结果表明:在接种72 h后,超量表达BnMAPK1植株叶片上病斑的扩散程度远小于对照植株,即转基因植株对核盘菌的抵抗能力显著提高,说明BnMAPK1可能对植株的抗病能力具有正向调控作用。7、利用高通量测序获得了超量表达BnMAPK1植株中的差异表达基因利用高通量测序手段,得到了转基因植株和对照植株的差异表达基因,对差异基因进行GO功能显著性富集分析和KEGG pathway显著性富集分析从整体上获得了差异基因富集的生物学过程、细胞组分、分子功能和信号通路。同时,对MAPK级联途径4大基因家族每个成员进行表达差异分析,发现MAPK1表达量升高后,MAPK级联途径中大部分基因的表达量虽然都出现了不同程度的变化,但变化幅度几乎都在2倍以内,说明整个MAPK级联途径中的基因在转录水平上比较稳定,从而保证了整个级联途径的稳定性。8、利用酵母双杂交获得甘蓝型油菜中与BnMAPK1互作的蛋白。利用酵母双杂交手段,初步获得甘蓝型油菜中与BnMAPK1互作的蛋白。经分析发现,它们主要与植物生长发育,生物和非生物胁迫相关。同时,在超量表达BnMAPK1的转基因植株中,这些基因的表达量都出现了不同程度的变化。通过酵母双杂交,我们从整体上了解了 BnMAPK1参与的生物学过程和信号通路。