论文摘要
必需脂肪酸（essential fatty acids）在人和高等动物体内不能合成,必须从食物中摄取。其中α-亚麻酸(α-linolenic acid, ALA, C18:3Δ9,12,15)和亚油酸（linoleic acid, LA, C18:2?9,12）是研究比较多的必需脂肪酸,α-亚麻酸属于n-3多不饱和脂肪酸（PUFAs）,它在体内经过一系列的脱氢和加长反应可以生成EPA、DHA等其它n-3 PUFAs。亚油酸属于n-6多不饱和脂肪酸（PUFAs）,经过一系列反应可以生成γ-亚麻酸（γ-linolenic acid, GLA）、花生四烯酸（arachidonic acid, AA）等其他n-6 PUFAs。n-6和n-3 PUFAs的功能在很多方面是相反的,它们相互协调制约,共同调节生物体的生命活动。所以n-6/n-3 PUFAs的膳食平衡非常重要,但是人的膳食中该比值一般严重偏高,n-6 PUFAs相对过量,n-3 PUFAs严重缺乏。这导致高血栓,动脉粥样化,癌症的发病率增加,炎症增强等症状。所以对油脂的研究方向应该是降低n-6/n-3PUFAs的比值,使其更加有利于人们的健康。对PUFAs的研究在分子生物学上体现在对PUFAs合成酶的研究。本试验所应用的酶即是催化由LA向ALA转化的酶。花生是世界第四大油料作物,作为我国的主要油料作物,其总产居各油料作物之首。我国花生50%以上用于榨油,花生油中LA的比例为15%-43% ,却不含任何n-3 PUFAs。因此通过转基因方法使得花生表达相关基因,促使部分LA转变成ALA,是改变花生种质的一种有效方法。大豆（Glycine max）种子油中ALA含量较高。Bilyeu KD等2003年克隆了大豆GmFAD3基因。在未成熟种子中,GmFAD3A和GmFAD3C的表达量分别是持家基因的60%和0.2%,GmFAD3B未检测到表达。并且他们发现GmFAD3A是大豆种子油中ALA水平主要贡献者,其贡献量是GmFAD3C的三倍。后来他们又发现GmFAD3A完全突变后,花生油中α-亚麻酸减少量大约为46g Kg-1油[1];而GmFAD3C完全突变后,花生油中α-亚麻酸减少量大约为15g Kg-1油。前者是后者的三倍。也就是说,GmFAD3A拥有300倍于GmFAD3C的表达量,却只有3倍于GmFAD3C的α-亚麻酸贡献量。由此可以推测,相同量的GmFAD3C与GmFAD3A的α-亚麻酸贡献量之比为100/1 ,因此GmFAD3C比GmFAD3A的活性要强的多,GmFAD3C分子比GmFAD3A分子更稳定。在大豆种子中,活性很高的GmFAD3C表达量很低,而活性极低的GmFAD3A表达量却极高。植物主要靠过量表达一个活性低的ω-3脂肪酸脱氢酶来贡献α-亚麻酸,而不是稍微多表达一点GmFAD3C。这其中的机制尚待进一步研究。因此本试验采用活性较高的GmFAD3C基因,在其表达后能够更容易分析花生中脂肪酸含量的变化。本实验用RT-PCR方法从大豆未成熟种子中扩增出GmFAD3C的cDNA,连入pUCm-T,得pUGFAD3C。最后连接到植物表达载体pROKⅡ中,建成了pROKⅡFAD3C重组载体,转化到农杆菌EHA105中,通过农杆菌介导转化花生丰花3号,用胚轴和子叶作为外植体,经过比较后发现胚轴作为外植体较为优异,由此建立了丰花3号的遗传转化体系。经过卡那霉素的筛选得到抗性苗,提取抗性苗的基因组DNA,用PCR以及PCR southern鉴定出了转基因植株。一方面通过气相色谱分析花生脂肪酸成份的变化可以进一步证明GmFAD3C的功能,另一方面,本工作可以在用分子生物学方法提高花生n-3 PUFAs含量,改善花生种质方面打下一定基础。