骨髓基质干细胞的分离培养及定向诱导分化的实验研究

论文摘要

目的:目前肝衰竭的治疗方法主要是靠细胞替代和肝移植,但由于供肝缺乏,尚存在免疫排斥反应,因而制约了肝移植的应用。骨髓基质干细胞（BMSCs）具有容易获得,可以自我复制,高度增殖,在特定的条件下可向各胚层来源的细胞分化的特点,因而将BMSCs细胞移植应用于肝病治疗有非常重要的临床价值。本研究摸索适合BMSCs生长的培养体系,探索BMSCs诱导分化为肝细胞的适合条件和机制,为临床上通过BMSCs细胞移植治疗肝脏疾病提供理论依据。 方法:用全骨髓法从大鼠骨髓中分离出BMSCs,观察BMSCs的生长特性,MTT法比较不同的培养条件对细胞活力的影响,摸索适合BMSCs生长的培养体系;探索在体外诱导BMSCs向成骨细胞、脂肪细胞分化的条件,证实BMSCs的多向分化潜能;将BMSCs在体外传代扩增后,培养体系中加入肝细胞提取液（G）和胎肝细胞培养上清液（CM）,模拟肝细胞体内生长的微环境,与加入肝细胞生长因子（HGF）、神经细胞生长因子（NGF）、维甲酸（RA）的诱导方法作比较,观察分化细胞的形态结构变化,并采用免疫细胞化学法检测肝细胞的特异性标志α1-抗胰蛋白酶和白蛋白,ICG染色法鉴定肝细胞的生成;将BrdU标记后的BMSCs进行异体移植,免疫组织化学法检测BMSCs在肝内的迁移和分化,PAS法检测所生成肝细胞的功能。 结果:（1） 使用低糖DMEM加入20%新生牛血清比10%新生牛血清MTT细胞活性增高（P<0.01）,使用高糖DMEM与低糖DMEM差异无显著性（P>0.05）,而用RPMI-1640则MTT活性降低（P<0.01）。（2） 本实验中分离的BMSCs在维生素C50μg/ml、地塞米松10-7mol/L、β-甘油磷酸钠10mmol/L的诱导条件下可以向成骨细胞分化,在地塞米松10-8mol/L、胰岛素10μg/ml的诱导条件下可以向脂肪细胞分化。（3） 免疫细胞化学法结果显示G、CM、NGF、HGF、RA诱导4d、14d、21d后与对照组相比α1-抗胰蛋白酶和白蛋白表达均呈阳性（P<0.01）,其中G、CM、NGF组AAT、ALB表达强于HGF、RA组（P<0.01）。AAT、ALB阳性的细胞形态上逐渐趋短变圆。（4） 形态上呈卵圆形的细胞PAS反应胞浆呈强阳性,有分泌储存糖原的功能。（5） 向肝细胞诱导后,卵圆形细胞能摄取ICG,呈现绿色。诱导3w后ICG阳性率比诱导2w高（P<0.01）。（6） BMSCs细胞移植后1周、4周损伤组受体肝脏

论文目录

• 引言
• 第一部分 骨髓基质干细胞的分离培养及向成骨细胞、脂肪细胞的诱导分化
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 体外诱导骨髓基质干细胞向肝细胞的分化
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分 体内诱导骨髓基质干细胞向肝细胞的分化
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 附图
• 附录
• 参考文献
• 综述
• 致谢
• 学位论文独创性声明