溶血磷脂酸抗缺氧无血清诱导的大鼠骨髓间充质干细胞凋亡及其信号转导机制研究

论文摘要

第一部分溶血磷脂酸抗缺氧无血清诱导的大鼠骨髓间充质干细胞凋亡作用骨髓间充质干细胞（BMSCs）是具有多向分化潜能的成体干细胞,在体外可以分化成为软骨细胞,脂肪细胞,骨细胞等,它们对造血干细胞起支撑作用。BMSCs还可以表达内皮细胞,平滑肌细胞,心肌细胞,骨骼肌细胞等特有的表面标志物。再加上BMSCs容易获取、没有免疫原性、无伦理学问题等优点,目前已经成为治疗缺血性心脏病的种子细胞之一。大量研究报道BMSCs移植到缺血心肌中有修复梗死心肌的潜能,但是由于移植入梗死心脏的BMSCs存活率很低,严重影响了细胞的修复功能。我课题组前期研究发现BMSCs在缺氧无血清环境中发生凋亡现象。溶血磷脂酸（LPA）是一种结构简单的水溶性磷脂信使,主要通过5种G蛋白耦联受体亚型发挥其广泛的生物学功能,不仅可以促进细胞骨架重排,还对细胞的生长、增殖、分化及细胞的信息传递产生多种影响,在心血管系统也有重要的作用。本文旨在研究以体外缺氧无血清条件模拟心肌缺血的微环境中,LPA对骨髓间充质干细胞（BMSCs）的抗凋亡作用及其作用机制。实验分为5组,第一组为对照组,正常培养;第二组为模型组,缺氧无血清联合处理6 h;第三组为LPA 1 h组,先用25μmol/L LPA预处理1 h,然后撤除LPA再进行缺氧无血清处理6 h;第四组为LPA 6 h组,无预处理过程,加入25μmol/L LPA同时进行缺氧无血清处理6 h;第五组为LPA 1+6h组,先用25μmol/L LPA预处理1 h,然后在保留LPA情况下进行缺氧无血清处理6 h。应用Hoecbst33342染色和膜联蛋白V/PI双染流式细胞术观察细胞凋亡,并利用Western印迹方法检测ERK1/2和Akt的磷酸化水平变化。研究结果表明缺氧无血清条件引起明显的BMSCs凋亡细胞凋亡率为24.2±3.12,LPA处理6 h和1+6 h组细胞凋亡率较凋亡模型组显著降低（P＜0.05）,细胞凋亡率分别为12.86±3.93、12.57±0.94。而1 h组细胞凋亡率与缺氧无血清组无显著性差异,细胞凋亡率为23.17±5.15。LPA处理组（1 h,6 h,1+6 h组）ERK1/2磷酸化水平较缺氧无血清组降低,Akt磷酸化水平较缺氧无血清组增高。在缺氧无血清环境中,LPA有利于增强BMSCs的抗凋亡能力。而且,本实验提示必须在持续存在的条件下,LPA才能维持促进细胞存活的信号通路的开放状态,发挥抗缺氧无血清诱导的凋亡作用。根据我们的实验结果,LPA 6 h和LPA 1+6 h组细胞凋亡率无显著性差异,说明LPA对BMSCs进行预处理效果不是很明显,提示在进行干细胞移植时不需用LPA进行预处理便可在BMSCs注入心肌的同时注射LPA,改善BMSCs的微环境,提高BMSCs存活率,从而进一步促进心梗后心功能的恢复,为临床提高BMSCs治疗缺血性心肌病的疗效提供理论依据。第二部分大鼠骨髓间充质干细胞LPA4、LPA5受体表达研究溶血磷脂酸（Lysophosphatidic acid,LPA）是一种活跃的磷脂类信号分子,在很多种细胞中发挥着不同的生理病理学作用,包括钙离子迁移,调节腺苷酸环化酶水平,激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）,促进神经发生,髓鞘形成,血管新生,伤口愈合以及肿瘤浸润等。LPA的各种生物学作用主要通过LPA受体介导下游信号通路完成,目前已知共有5种LPA受体亚型,分别为LPA1/Edg2/vzg-1,LPA2/Edg/4,LPA3/Edg7,LPA4/Gpr23/p2y9,LPA5/Gpr92。LPA1-3受体属于Edg家族（内皮分化基因家族）,但LPA4与LPA1-3仅有20%-24%的氨基酸序列是同源的,而LPA5与LPA4的氨基酸序列同源性达35%,系统进化分析法认为LPA4和LPA5不属于Edg家族。在本研究中,我们首次发现在大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）中表达LPA4和LPA5,DNA测序结果显示各引物扩增产物与Genbank中预测的序列同源性均达100%,用Blast将大鼠LPA4、LPA5扩增产物分别与人和小鼠源性LPA4、LPA5核苷酸序列进行比对,发现大鼠LPA4扩增产物与人、小鼠源性LPA4核苷酸序列同源性分别达87%、95%;大鼠LPA5扩增产物与人、小鼠源性LPA5核苷酸序列同源性分别达86%、89%。Real TimePCR结果显示在缺氧无血清诱导的BMSCs凋亡中LPA4显著性升高,而LPA5却显著性降低。因此,我们初步推测LPA4和LPA5表达水平的这种异常变化可能与BMSCs凋亡有关。

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第一部分溶血磷脂酸抗缺氧无血清诱导的大鼠骨髓间充质干细胞凋亡作用

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第二部分大鼠骨髓间充质干细胞LPA4、LPA5受体研究