脂肪酶产生菌的选育及其固定化研究

论文摘要

生物柴油是生物质能的一种形式,具有绿色、可再生、能耗低等特点,能够缓解石油即将枯竭和环境污染对人类造成的危机,成为国内外重点研究开发的热点。本文主要进行以下方面的研究:(1)产脂肪酶菌株的分离筛选和初步鉴定。从含油土壤中分离微生物,通过油脂同化培养基平板筛选到一株产脂肪酶菌株。根据微生物分类学方法筛选菌株初步鉴定为地霉属(Geotrichum Link),命名为Geotrichum Candidum NS3,摇瓶发酵初始水解酶活为321 U/g dry cell、合成酶活为0.18 U/g dry cell。(2)筛选菌株的诱变和稳定性检测。以Geotrichum Candidum NS3为出发菌株,进行了常规的紫外线(UV)和亚硝基胍(NTG)的诱变。经过几轮的处理和筛选,得到了一株水解酶活490U/g dry cell,合成酶活0.35U/g dry cell的突变菌,突变株命名为Geotrichum Candidum NS3T3。经过5次连续传代和发酵检测,其代谢酶活和遗传性能稳定。(3)筛选菌Geotrichum Candidum NS3T3的固定化研究。以聚氨酯泡沫为载体对产脂肪酶Geotrichum Candidum NS3T3细胞进行固定化条件实验研究,经过显示,其优化的固定化条件为:聚氨酯泡沫颗粒尺寸6×6×6mm,密度27kg/m~3,固定培养60小时,有73.8%的细胞进入聚氨酯泡沫中生长固定,载体固定细胞干重达到2.32g/g载体。固定化颗粒电镜图片显示,Geotrichum Candidum NS3T3菌丝在载体孔隙内和脊壁上缠绕充盈,生长良好,固定结构稳定。固定化细胞连续催化反应表现出较好的操作稳定性和酶活保持率。通过单因素比较实验对Geotrichum Candidum NS3T3发酵培养条件进行了优化。结果显示:在接种量12%,装液量50mL(250mL三角瓶),28℃,转速为180r/min,细胞生长和发酵产酶活力较高,培养菌丝合成酶活达0.54U/g dry cell。以固定化Geotrichum CandidumNS3T3细胞颗粒作为催化剂,采用填充床(PBR)反应模式来进行催化反应,薄层色谱法定性跟踪监测脂肪酸甲酯的生成,实验结果显示,固定化GeotrichumCandidum NS3T3能有效催化桐籽油合成生物柴油。(4)聚氨酯泡沫固定产脂肪酶粗状假丝酵母(Candida Valida T2)细胞的固定化研究。通过对聚氨酯泡沫颗粒密度和粒径筛选、酸碱处理、以及固定化培养中的固液比优化,聚氨酯泡沫载体固定Candida Valida T2细胞干重达到1571mg/g,固定化细胞脂肪酶的水解酶活达1415U/g dry cell。固定化细胞颗粒电镜图片显示粗状假丝酵母菌(Candida Valida T2)在载体孔隙内和脊壁上缠绕充盈,生长良好,固定结构稳定。固定化细胞连续催化水解桐籽油5批次,细胞相对水解酶活保持73%,固定细胞的损失率为12.5%。固定化细胞颗粒显示出良好的操作稳定性和酶活保持率。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 绪论
• 1.1 生物柴油概述
• 1.1.1 前言
• 1.1.2 生物柴油的定义
• 1.1.3 生物柴油的特性
• 1.1.4 生物柴油的可行性分析
• 1.1.5 生物柴油的生产方法
• 1.1.6 国内外生物柴油发展现状
• 1.1.7 发展生物柴油的前景及意义
• 1.2 微生物脂肪酶概述
• 1.2.1 脂肪酶的结构
• 1.2.2 脂肪酶菌种的筛选，分离，鉴定
• 1.2.3 诱变筛选
• 1.2.4 脂肪酶酶活检测
• 1.3 细胞固定化
• 1.3.1 固定化方法
• 1.3.2 固定化细胞的载体材料
• 1.4 我国发展生物柴油的原料选择
• 1.4.1 发展木本油料植物
• 1.4.2 发展微生物油脂技术
• 1.4.3 发展油料作物
• 1.4.4 废油脂利用
• 1.5 课题来源及研究意义
• 1.5.1 课题来源
• 1.5.2 研究意义
• 1.6 本文的主要研究内容
• 第2章 脂肪酶产生菌的筛选及鉴定
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 实验方法
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 筛选结果
• 2.2.2 菌株鉴定
• 2.2.3 讨论
• 2.3 本章小结
• 第3章 脂肪酶产生菌的诱变筛选
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 实验方法
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 紫外诱变选育结果
• 3.2.2 亚硝基胍诱变选育结果
• 3.2.3 复合诱变选育结果
• 3.2.4 突变株的产酶稳定性
• 3.2.5 讨论
• 3.3 本章小结
• 第4章 脂肪酶产生菌GeotrithumCandidum NS3T3固定化研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 实验方法
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 载体因素对细胞固定化的影响
• 4.2.2 培养细胞的分布和固定化细胞的稳定性检测
• 4.2.3 载体内细胞生长固定方式的微观考察
• 4.2.4 固定化细胞酶催化稳定性考察
• 4.2.5 固定化细胞的培养条件
• 4.2.6 TLC结果
• 4.2.7 讨论
• 4.3 本章小结
• 第5章 聚氨酯泡沫固定产脂肪酶粗状假丝酵母细胞的研究
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 实验方法
• 5.2 结果与讨论
• 5.2.1 载体因素对细胞固定化的影响
• 5.2.2 培养细胞的分布和固定化细胞的稳定性检测
• 5.2.3 载体内细胞生长固定方式的微观考察
• 5.2.4 固定化细胞酶催化稳定性考察
• 5.3 本章小结
• 第6章 结论与展望
• 6.1 结论
• 6.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 攻读学位期间的研究成果