NOV基因在少突胶质细胞前体细胞发育分化及缺血缺氧性白质损伤中作用的研究

论文摘要

少突胶质细胞前体细胞（oligodendrocyte precursor cells,OPCs）是成年中枢神经系统中广泛分布的干细胞或干细胞样细胞,体外培养成年OPCs具有自我更新增殖和不对称分化能力,其标记物有NG2、血小板衍化生长因子α受体（platelet derived growth factors receptorα, PDGFR-α）和O4。OPCs与病毒感染、免疫反应、神经退行性疾病、CO等毒性物质作用及营养代谢障碍和缺血缺氧所致的白质损害密切相关。但对OPCs在中枢神经系统发育分化及再生中的作用,尚存在众多有待解决的问题。OPCs是少突胶质细胞的细胞系,但是否仅是少突胶质细胞的后备储存池尚存在众多的质疑。NG2+细胞的分布,在灰质多于髓鞘生成区-白质,在缺氧、缺血、外伤、炎症及毒性物质作用下产生明显的反应性增殖,它区别于星形胶质细胞和小胶质细胞在于其反应为一过性的、而且局限于伤灶周围。在神经退行性疾病如侧束硬化症时NG2+细胞数量增多而且免疫反应显著加强。但至今为止,在整体实验中,OPCs移植有报告能改善髓鞘生成,但未能提供OPC参加损伤修复、增强髓鞘生成的直接实验依据。有关OPCs的细胞生物学及电生理特性特别是发育分化方面的研究,国内少有报告。脑缺血缺氧损伤已成为新生儿脑损伤的重要形式,婴幼儿发育中脑对缺血缺氧的易感性,常导致脑室周围白质软化（periventricular leukomalacia, PVL）,临床称为小儿脑瘫。尽管当今围产期监测、孕期和新生儿监护等方面的医疗技术取得了长足的发展,但是新生儿缺血缺氧性脑病（hypoxic-ischemic encephalopathy, HIE）的发生率却无明显降低,平均每1000和活产足月儿中,就有3-4个婴儿发病,早产儿的发病率更高,其中10%-60%在新生儿期失望,25%以上的患儿遗留永久的神经心理缺陷,如脑瘫、精神发育迟滞、学习困难和癫痫。少突胶质前体细胞损伤是PWMI形成的主要原因和中心环节。未成熟脑白质中对缺氧缺血高度敏感的OPCs的大量死亡以及分化发育障碍是PWMI形成的关键。因此,深入研究OPCs缺氧缺血性损伤机制,是阐明早产儿脑白质损伤机理,寻找预防和治疗药物,降低早产儿死亡率和致残率的重要途径。迄今为止,对OPCs缺氧缺血损伤机制所知有限,可能与谷氨酸兴奋毒性、炎症介质、氧化应激、细胞内Ca2+超载等多种因素有关。然而针对这些机制的干预措施并未转化为临床治疗成果。肾母细胞瘤过度表达基因（Nephroblastoma Overexpression gene, NOV）是一种原癌基因。其所编码产物（NOV蛋白）是一种胰岛素样生长因子（Insulin-like Growth Factor,IGF）结合蛋白（IGF-binding proteins, IGFBPs）,属于IGF家族的成员,它通过调节IGF与IGF受体的结合状态而对IGF功能的发挥调控作用,具有影响神经干细胞增殖、分化和存活的功能。IGF-I是属于胰岛素家族成员,是一类多功能多效应的细胞增殖调控因子。目前研究认为IGF-I是神经干细胞增殖所必需,IGF-1可依循受体酪氨酸蛋白激酶途径作用与神经干细胞。缺乏IGF-I的作用,bFGF和EGF都不能有效刺激体外神经干细胞的增殖,同时IGF-I可以促进神经干细胞分化成少突胶质细胞。OPCs属于具干细胞性质的前体细胞,NOV基因对其发育分化的作用如何,尚未见有文献报道,是一个值得探讨的向题。Marian Zaka（2005）及Shuying Lin（2005）先后报告IGF-1具有促OPCs增殖和减少其毒性物质诱发OPCs的凋亡,从而改善缺血缺氧所致的脑白质损伤。既然NOV基因是动物神经系统发育、再生的重要调控因子,IGF系其编码结合蛋白,将其应用于OPCs的研究,可以观察其对OPCs发育分化及缺血、缺氧性白质损伤的作用。本实验分为三个部分：第一部分：运用PDGFaR抗体来分析生后大鼠脑中OPCs的形态、分布和密度等发育规律,同时观察其电生理特征。结合以前的研究报道与NG2+细胞进行比较,同时,对不同发育时期的不同脑区应用相邻切片进行PDGFaR和NG2的免疫荧光染色,比较PDGFaR+和NG2+的细胞密度的变化与脑发育的相关性。期望这些数据能够帮助我们对中枢神经系统中OPCs的生物学特性有进一步的了解。主要结果如下：1、大鼠中枢神经系统PDGFaR+OPCs在形态、分布、密度的发育规律及电生理学特性等方面与NG2+OPCs高度相似。2、老年大鼠脑中有约25%的NG2+OPCs表达PDGFaR阴性,但是在形态上与NG2+/PDGFaR+OPCs相似。3、老化对OPCs的形态、数量和发育调控有影响。上述结果表明PDGFaR和NG2都是OPCs的标记物。PDGFaR主要在发育的未成熟前体细胞上表达。而在少突胶质细胞成熟前期,PDGFaR的表达已经消失,而NG2还在持续表达。NG2免疫阳性细胞可能不同于传统意义上的少突胶质前体细胞,而是一种成熟的胶质细胞。第二部分：联合应用耗氧剂和无糖培养基在常氧培养条件下建立新生未成熟大鼠少突胶质前体细胞缺氧缺糖模型,并观察缺氧缺糖对细胞形态和存活率的影响。同时,利用P4大鼠左侧颈总动脉结扎后吸入8%氧气2小时建立新生大鼠脑缺血缺氧模型,观察脑组织病理学改变、MBP和PDGFaR的表达情况。评估离体与在体少突胶质前体细胞缺血缺氧模型是否有效。主要结果如下：1、联合应用无糖DMEM培养基和连二亚硫酸钠后,培养OPCs出现明显的形态学改变,细胞突起肿胀、变形、断裂,细胞水肿,并随时间延长而加剧。少突胶质前体细胞存活率随缺氧缺糖时间的延长而逐渐下降,30min、60min和90min细胞存活率均明显低于正常对照组,差异有统计学意义（P均<0.05）。2、P4大鼠左侧颈总动脉结扎后吸入8%氧2小时,脑组织发生病理学改变；神经细胞凋亡数量增加；MBP、NF200和PDGFaR的表达均下降。上述结果表明利用无糖培养基和连二亚硫酸钠可以在常氧培养条件下建立体外培养的少突胶质前体细胞缺氧缺糖模型。利用P4大鼠左侧颈总动脉结扎后吸入8%氧气2小时可建立新生大鼠脑缺血缺氧模型。应用这两种在体与离体模型,可模拟缺氧缺血对新生儿大脑造成的损伤。第三部分：将NOV cDNA全长序列克隆到pEGFP-N1真核表达质粒上,再将重组质粒转染到COS-7细胞中,用免疫细胞化学技术和Western Blot方法检测NOV的表达。收集培养NOV/COS-7细胞的条件培养液（NOV-CM）,观察NOV基因对缺血缺氧脑损伤模型中OPCs增殖和分化的影响以及能否促进神经损伤的修复。主要结果如下：1、利用RT-PCR的产物,采用定向克隆的方法,成功地将NOV cDNA全长序列克隆到pEGFP-N1真核表达质粒上,对克隆的cDNA片段进行核酸测序,证明获得的重组子完全符合设计要求。在此基础上,将重组质粒转染到COS-7细胞中,用免疫细胞化学技术和Western Blot方法检测到COS-7细胞与COS-7细胞的培养上清液中均有NOV的表达。2、在构建了NOV基因真核表达载体的基础上,将载体转染到COS-7细胞中,收集NOV/COS-7细胞上清液（NOV-CM）,对少突胶质前体细胞缺血缺氧离体与在体模型进行治疗。结果发现其NOV-CM不仅对OPCs缺血缺氧损伤具有一定的保护作用,并对神经元和髓鞘的损伤修复有促进。结果提示NOV基因有可能具有保护神经损伤后再生和功能重建的作用,为临床治疗缺氧缺血脑损伤提供了线索。

论文目录

• 常用英文缩写一览表
• 英文摘要
• 中文摘要
• 总材料与方法
• 第一部分 OPCs在大鼠脑的免疫组织化学定位及发育学表达
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 第二部分 缺血缺氧脑损伤大鼠模型中OPCs的细胞生物学特性
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 第三部分 NOV基因对缺血缺氧脑损伤大鼠模型中OPCs的影响
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 全文总结
• 致谢
• 照片
• 文献综述 血小板衍化生长因子α受体的研究进展
• 参考文献
• 攻读博士期间发表论文
• 英文论著