熊果酸对局灶性脑缺血再灌注损伤小鼠的脑保护作用及其信号转导机制研究

论文摘要

缺血性脑血管病是临床常见病、多发病之一,根据国际卫生组织统计,在全球范围内平均每400个人中就有一个缺血性脑血管病患者,缺血性脑血管病造成的死亡率仅次于心脏疾病,在所有的缺血性脑血管病患者中有大约30%患者由于溶栓治疗或栓子自发向远端推移出现血管再通,而出现缺血再灌注损伤。随着现代免疫学和分子生物学的迅速发展,认为脑缺血再灌注损伤的病理生理机制是一种损伤级联反应,主要包括兴奋性氨基酸毒性、氧化应激、凋亡、细胞内钙超载、自由基损伤、炎症损害等,这几种因素相互作用、相互影响,构成了一个复杂的调控网络,形成恶性循环,最终导致细胞凋亡或坏死。目前已有许多合成或天然物质的神经保护剂进入实验研究,虽然理论上应用神经保护剂可治疗脑梗死,但是这些神经保护剂在临床治疗中并没有取得预期的效果,出现临床和理论的严重脱节。出现这种现象最主要的原因是动物与人类生理机制及耐受性等方面的差异,另外,由于脑缺血后级联反应的复杂性,可能单一使用阻断某一病理环节的药物难以奏效。在我们目前的临床治疗中,理想的神经保护剂应该具备针对缺血再灌注损伤多个损伤环节发挥“一个靶点,多重保护”作用的特性。熊果酸（Ursolic Acid, UA）是存在于天然植物中的一种五环三萜系化合物,主要存在于熊果、夏枯草、铁冬青等植物中。研究表明UA具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗凋亡、抗病毒、增强免疫功能等多种生物学作用,并且毒副作用低,具有良好的临床应用潜力。临床上,缺血性脑血管疾病多为局灶性,部分患者由于溶栓治疗或栓子自发向远端推移出现血管再通即再灌注现象,因此,制备局灶性脑梗死并且可实现再灌注的动物模型更为接近临床实际情况。本研究选用雄性CD-1小鼠、Nrf2–/–、Nrf2+/+小鼠为研究对象,采用线栓法建立脑缺血再灌注模型,动态观察缺血再灌注损伤后Nrf2/ARE信号转导通路与氧化损伤、炎症反应及神经分化的关系,并选用五环三萜系化合物UA进行干预,评价干预前后梗死体积、神经功能缺损评分,以及UA对Nrf2/ARE信号通路的激活在缺血再灌注损伤后的脑保护作用机制进行初步探讨。本研究分三部分,现将各部分内容概述如下。第一部分熊果酸对局灶性脑缺血再灌注损伤小鼠的抗氧化作用及其相关信号转导机制研究目的:观察脑缺血再灌注损伤后不同时间点Nrf2/ARE通路的活性变化,研究熊果酸对缺血再灌注小鼠的抗氧化作用,探讨熊果酸抗氧化作用的相关信号转导机制。方法:选用成年雄性CD-1小鼠、Nrf2–/–、Nrf2+/+小鼠为研究对象,采用改良线栓法制备大脑中动脉缺血再灌注模型。试验1:随机将CD-1小鼠分为2组:假手术组（Sham）（n=30）,手术组（MCAO）,每组又根据不同的时间点分为3 h、24 h、48 h、72 h、7 d五个亚组（n=90）。试验2:随机将CD-1小鼠分为4组:假手术组（Sham）、手术组（Vehicle）、小剂量熊果酸干预组（L-UA）（68 mg/Kg）、大剂量熊果酸干预组（H-UA）（130 mg/Kg）。试验3:采用随机的方法分别将Nrf2–/–、Nrf2+/+小鼠分为3组:假手术组（Sham）、手术组（Vehicle）、大剂量熊果酸干预组（H-UA） （130 mg/Kg）。Sham组:假手术后腹腔注射等量PBS+1%DMSO , Vehicle组:缺血再灌注术后腹腔注射等量PBS+1%DMSO,L-UA组:缺血再灌注术后腹腔注射熊果酸68 mg/Kg。H-UA组:缺血再灌注术后腹腔注射熊果酸130 mg/Kg。各组取材前进行神经功能评分,TTC染色评价脑梗死体积,HE染色观察组织学改变,检测脑组织中丙二醛（MDA）含量的变化情况,分别用RT-qPCR的方法和Western blot的方法检测缺血脑组织Nrf2、HO-1 mRNA和蛋白水平的变化、Confocal观察Nrf2核转位的形态学改变。结果:在缺血再灌注早期Nrf2、HO-1、MDA的表达呈逐渐升高的趋势,至24 h达高峰,持续到48 h,自72 h开始逐渐下降。两种剂量熊果酸干预后均可以改善脑缺血再灌注后小鼠的神经功能缺失评分,H-UA组与Vehicle组相比可明显降低神经功能缺损,差异有统计学意义（1.78±0.30 vs. 2.47±0.46（）P<0.05）,而L-UA组与Vehicle组相比可降低神经功能缺损,但差异无统计学意义（2.01±0.65 vs. 2.47±0.46）（P>0.05）,两种剂量熊果酸干预后均可降低脑缺血再灌注后小鼠的脑梗死体积,H-UA组与Vehicle组相比可明显减轻梗死体积,差异有统计学意义（0.30±0.02 vs. 0.48±0.04） （P<0.05）,而L-UA组与Vehicle组相比可减轻梗死体积,但差异无统计学意义（0.38±0.03 vs. 0.48±0.04）（P>0.05）。两种剂量熊果酸干预后均可降低脑缺血再灌注后小鼠的MDA含量,H-UA组与Vehicle组相比可明显减低MDA含量,差异有统计学意义（2.06±0.29 vs. 3.55±0.67（）P<0.05）,而L-UA组与Vehicle组相比可降低MDA含量,但差异无统计学意义（2.98±0.56 vs. 3.55±0.67）（P>0.05）。Nrf2、HO-1 mRNA表达以RQ值表示,Sham组、Vehicle组、L-UA组、H-UA组Nrf2与HO-1的RQ值分别为:0.22±0.27,0.85±0.10,0.70±0.05,0.53±0.06;0.70±0.02,1.80±0.04,1.45±0.10,1.20±0.08。统计结果显示H-UA可明显诱导Nrf2、HO-1 mRNA表达增加,差异有统计学意义（P<0.05）,而L-UA组可诱导Nrf2、HO-1 mRNA表达增加,但差异无统计学意义（P>0.05）。Nrf2核蛋白及HO-1蛋白的表达变化与基因水平改变类似。在Nrf2+/+小鼠中,再灌注24 h后,Western-bloting的结果显示,与Vehicle组相比,H-UA能够明显诱导Nrf2核蛋白、HO-1蛋白的表达,然而在Nrf2–/–小鼠中,H-UA的诱导能力被阻滞,而且神经功能缺失更严重。结论:局灶性脑缺血再灌注后,缺血脑组织的MDA、Nrf2、HO-1水平存在一个相关性动态表达的变化过程,提示Nrf2/ARE通路可能与抗氧化作用有一定相关性;UA对局灶性缺血再灌注脑损伤小鼠有确切的神经保护作用,可改善脑缺血再灌注损伤后的神经功能缺失,减小脑梗死体积,诱导Nrf2、HO-1的表达,减少MDA含量,因此我们推测UA的神经保护可能是通过Nrf2/ARE通路的激活实现;而在Nrf2–/–小鼠脑缺血再灌注模型的观察中,上述推测得到了进一步证实,在Nrf2–/–小鼠模型中氧化损伤更明显,UA的抗氧化作用被阻滞,说明Nrf2/ARE通路的激活是UA发挥其抗氧化作用之一,从而实现其神经保护作用。第二部分熊果酸对局灶性脑缺血再灌注损伤小鼠的抗炎作用及其相关信号转导机制研究目的:观察脑缺血再灌注损伤后不同时间点TLR4/NF-κB的活性变化,研究熊果酸对缺血再灌注小鼠的抗炎作用,探讨熊果酸抗炎作用的相关信号转导机制。方法:选用成年雄性CD-1小鼠、Nrf2–/–、Nrf2+/+小鼠为研究对象,采用改良线栓法制备大脑中动脉缺血再灌注模型。试验1:随机将CD-1小鼠分为2组:假手术组（Sham） （n=30）,手术组（MCAO）,每组又根据不同的时间点分为3 h、24 h、48 h、72 h、7 d五个亚组（n=90）。试验2:随机将CD-1小鼠分为4组:假手术组（Sham）、手术组（Vehicle）、小剂量熊果酸干预组（L-UA）（68 mg/Kg）、大剂量熊果酸干预组（H-UA）（130 mg/Kg）。试验3:采用随机的方法分别将Nrf2–/–、Nrf2+/+小鼠分为3组:假手术组（Sham）、手术组（Vehicle）、大剂量熊果酸组（H-UA） （130 mg/Kg）。Sham组:假手术后腹腔注射等量PBS+1%DMSO , Vehicle组:缺血再灌注术后腹腔注射等量PBS+1%DMSO,L-UA组:缺血再灌注术后腹腔注射熊果酸68 mg/Kg,H-UA组:缺血再灌注术后腹腔注射熊果酸130 mg/Kg。各组取材前进行神经功能评分,分别用RT-qPCR的方法和Western-bloting的方法检测缺血脑组织中TLR4、NF-κB mRNA和蛋白水平的变化。结果:在缺血再灌注早期TLR4、NF-κB的表达呈逐渐升高的趋势,至24 h达高峰,持续到48 h,自72 h开始逐渐下降。两种剂量熊果酸干预后均可以降低脑缺血再灌注后小鼠的炎症表达, TLR4/NF-κB mRNA表达以RQ值表示,Sham组、Vehicle组、L-UA组、H-UA组TLR4/NF-κB的RQ值分别为:0.40±0.31,1.69±0.09,1.20±0.13,1.00±0.26;0.50±0.04,1.52±0.25,1.30±0.09,0.96±0.40。统计结果显示H-UA可明显减轻TLR4/NF-κB mRNA表达,差异有统计学意义（P<0.05）,而L-UA组可减轻TLR4/NF-κB mRNA表达增加,但差异无统计学意义（P>0.05）。TLR4、NF-κB核蛋白的表达变化与基因水平改变类似。在Nrf2+/+小鼠中,再灌注24 h后,Western-bloting的结果显示,与Vehicle组相比,H-UA能够明显抑制TLR4、NF-κB核蛋白的表达,然而在Nrf2–/–小鼠中炎症表达更严重,与Vehicle组相比,H-UA的抑制能力被阻滞。结论:局灶性脑缺血再灌注后,缺血脑组织的TLR4、NF-κB动态表达的变化过程与脑组织损伤程度一致,提示TLR4/NF-κB通路的炎症损伤参与了脑缺血再灌注损伤;UA可下调TLR4、抑制NF-κB的核转位,从而减轻缺血再灌注后脑组织的过度炎症反应,实现缺血再灌注后的神经保护作用;结合第一部分试验结果,UA抑制TLR4/NF-κB表达与诱导Nrf2/ARE表达上调,减少MDA含量存在一致性,故我们推测UA的抗炎作用可能是通过Nrf2/ARE信号转导通路发挥作用,从而实现UA的抗氧化、抗炎的神经保护作用;而在Nrf2–/–小鼠脑缺血再灌注模型的观察中,上述推测得到进一步证实,在Nrf2–/–小鼠模型中炎症损伤更严重,UA的抗氧化、抗炎作用被阻滞,说明Nrf2/ARE通路激活是UA发挥其抗氧化、抗炎作用之一,从而实现其神经保护作用。第三部分熊果酸对局灶性脑缺血再灌注损伤小鼠的促进神经分化作用及其相关信号转导机制研究目的:观察脑缺血再灌注损伤后不同时间点神经分化标志物NF-M、NF-H、α-Tub的动态变化,研究熊果酸对缺血再灌注小鼠的促进神经分化作用,探讨熊果酸促进神经分化作用的相关信号转导机制。方法:选用成年雄性CD-1小鼠、Nrf2–/–、Nrf2+/+小鼠为研究对象,采用改良线栓法制备大脑中动脉缺血再灌注模型。试验1:随机将CD-1小鼠分为2组:假手术组（Sham） （n=30）,手术组（MCAO）,每组又根据不同的时间点分为3 h、24 h、48 h、72 h、7 d五个亚组（n=90）。试验2:随机将CD-1小鼠分为4组:假手术组（Sham）、手术组（Vehicle）、小剂量熊果酸组（L-UA）（68 mg/Kg） （n=18）、大剂量熊果酸组（H-UA）（130 mg/Kg）。试验3:采用随机的方法分别将Nrf2–/–、Nrf2+/+小鼠分为3组:假手术组（Sham）、手术组（Vehicle）、大剂量熊果酸组（H-UA） （130 mg/Kg）。Sham组:假手术后腹腔注射等量PBS+1%DMSO , Vehicle组:缺血再灌注术后腹腔注射等量PBS+1%DMSO,L-UA组:缺血再灌注术后腹腔注射熊果酸68 mg/Kg,H-UA组:缺血再灌注术后腹腔注射UA130 mg/Kg。各组取材前进行神经功能评分,分别用RT-qPCR的方法和Western-bloting的方法检测缺血脑组织NF-M、NF-H、α-Tub mRNA和蛋白水平的变化规律。结果:在缺血再灌注早期NF-M、NF-H、α-Tub的表达呈逐渐降低的趋势,至24 h达低谷,持续到72 h,其中NF-M自第7 d开始逐渐回升,而NF-H、α-Tub表达无明显回升。两种剂量熊果酸干预后均可以上调脑缺血再灌注后小鼠的NF-M表达,而对NF-H、α-Tub的表达无明显影响。NF-M、NF-H、α-Tub mRNA表达以RQ值表示,Sham组、Vehicle组、L-UA组、H-UA组NF-M、NF-H、α-Tub的RQ值分别为:NF-M 1.80±0.53,0.76±0.10,0.85±0.03,1.02±0.26;NF-H 1.50±0.14,0.41±0.05,0.42±0.19,0.48±0.05;α-Tub 1.50±0.14,0.58±0.05,0.52±0.03,0.56±0.04。统计结果显示H-UA可明显上调NF-M mRNA表达,差异有统计学意义（P<0.05）,而L-UA组可上调NF-M mRNA表达,但差异无统计学意义（P>0.05）。两种剂量熊果酸干预后对NF-H、α-Tub的表达无明显影响。NF-M、NF-H、α-Tub蛋白的表达变化与基因水平改变类似。在Nrf2+/+小鼠中,再灌注24 h后,Western-bloting的结果显示,与Vehicle组相比,H-UA能够明显诱导NF-M蛋白的表达,然而在Nrf2–/–小鼠中,H-UA的诱导能力被阻滞。结论:局灶性脑缺血再灌注后,缺血脑组织中NF-M、NF-H、α-Tub动态表达的变化过程与脑组织损伤程度一致;UA可上调NF-M的表达,而NF-H、α-Tub表达未受影响,可能与NF-M主要出现在神经分化的早期,而NF-H主要出现在神经分化的晚期有关;结合第一部分试验结果,UA促进NF-M表达与诱导Nrf2/ARE表达上调存在一致性,故我们推测熊果酸的促进神经分化作用可能是通过Nrf2/ARE信号转导通路发挥作用,从而实现UA的促神经分化的神经保护作用;而在Nrf2–/–小鼠脑缺血再灌注模型的研究中,上述推测得到进一步证实,在Nrf2–/–小鼠中神经分化标注物降低更明显,而UA促进神经分化的作用被阻滞,说明Nrf2/ARE通路的激活是UA发挥促进神经分化的作用之一,从而实现其神经保护作用。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 英文缩写
• 引言
• 第一部分 熊果酸对局灶性脑缺血再灌注损伤小鼠的抗氧化作用及其相关信号转导机制研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第二部分 熊果酸对局灶性脑缺血再灌注损伤小鼠的抗炎作用及其相关信号转导机制研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第三部分 熊果酸对局灶性脑缺血再灌注损伤小鼠的促进神经分化作用及其相关信号转导机制研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 结论
• 综述一
• 参考文献
• 综述二
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历