东方百合木质素合成相关基因的克隆及功能分析

论文摘要

本文比较了东方百合两个品种在生长过程中细胞结构和木质素含量的变化,从“索蚌”中克隆了木质素合成相关基因——肉桂酰辅酶A还原酶和4-羟基肉桂酰辅酶A连接酶,分别命名为LsCCR1及Ls4CL。主要结论如下:1、“索蚌”和“西伯利亚”两个品种茎杆中木质素快速积累的时期及速度有差异。2、LsCCR1基因分析发现,该基因cDNA全长为1499bp,包括完整的阅读框,编码388个氨基酸。半定量PCR检测LsCCR1基因在百合不同组织中的表达差异显示该基因主要在茎杆中表达,根部次之,叶片、鳞茎及花蕾中表达量较少。荧光定量PCR方法检测两个东方百合品种不同时期茎杆上、部的LsCCR1基因的表达差异表明, LsCCR1基因的RNA表达量上部明显高于下部,且在不同的时间段其表达趋势亦不同。3、构建了LsCCR1基因组成型过量表达载体转化烟草,经RT-PCR检测结果显示,挑选的11棵转化植株RNA水平均有表达,但表达量有较大差异。转化植株表型差异较大,株高差异明显,部分植株花型及花色也有改变。4、Ls4CL基因的分析表明,该基因cDNA全长为1966bp,包括完整的阅读框,编码548个氨基酸。利用半定量PCR检测Ls4CL基因在百合不同组织中的表达差异,结果显示Ls4CL基因主要在茎杆中表达,根部次之,叶片、鳞茎及花蕾中表达量相对稍低。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1、木质素的结构特征
• 2、木质素生物合成的途径
• 3、木质素与植物抗病性
• 4、木质素生物合成的基因工程
• 4.1 利用基因工程抑制木质素的合成
• 4.2 利用基因工程提高木质素含量
• 5、CCR 基因的研究进展
• 5.1 CCR 基因的组织表达特征
• 5.2 CCR 基因启动子的研究
• 6、4CL 基因的研究进展
• 第二章 东方百合两个品种茎杆细胞结构及木质素测定分析
• 1、东方百合茎杆不同发育时期的细胞结构（石蜡切片）
• 1.1 材料、试剂与设备
• 1.1.1 实验材料
• 1.1.2 FAA 固定液
• 1.1.3 脱水所用试剂
• 1.1.4 浸蜡与包埋所用试剂
• 1.1.5 脱蜡水化及染色所用试剂
• 1.1.6 实验设备
• 1.2 东方百合茎杆不同发育时期的细胞切片的制备及观察
• 1.2.1 材料的固定
• 1.2.2 材料的脱水
• 1.2.3 浸蜡
• 1.2.4 材料的包埋、切片、展片、染色及封片
• 1.2.5 切片观察分析
• 1.3 结果与分析
• 2、百合茎杆不同发育时期木质素含量的测定
• 2.1 实验材料
• 2.2 酸不溶木质素含量的测定
• 2.2.1 试剂及仪器
• 2.2.2 测定方法和计算
• 2.3 酸溶木质素含量的测定
• 2.3.1 应用仪器及器皿
• 2.3.2 应用试剂和溶液
• 2.3.3 试样制备
• 2.3.4 测定方法和计算
• 2.4 结果与分析
• 3、结论与讨论
• 第三章 东方百合LSCCR1 基因的克隆及功能分析
• 1、材料与方法
• 1.1 材料及菌株
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 菌株与质粒
• 1.2 试剂
• 1.3 仪器
• 1.4 百合LsCCR1 基因的克隆
• 1.4.1 总RNA 的提取及鉴定
• 1.4.2 目的片段的分离
• 1.4.3 目的基因3’端cDNA 的分离
• 1.4.4 目的基因5’端cDNA 的分离
• 1.5 LsCCR1 基因的序列分析
• 1.6 LsCCR1 基因的组织表达特异性分析
• 1.6.1 百合总RNA 的提取
• 1.6.2 半定量RT-PCR 方法进行组织表达特异性分析
• 1.7 荧光定量PCR 方法进行
• 1.7.1 RNA 的提取
• 1.7.2 cDNA 的获得
• 1.7.3 荧光定量PCR 的引物
• 1.7.4 定量PCR 反应体系及扩增条件
• 1.8 正义表达载体的构建
• 1.8.1 全长cDNA 的分离
• 1.8.2 目的基因与植物表达载体的连接及转化
• 1.8.3 重组子的鉴定
• 1.8.4 重组子转化农杆菌
• 1.9 农杆菌介导的烟草转化
• 1.9.1 植物培养基
• 1.9.2 农杆菌的活化及菌液的制备
• 1.9.3 农杆菌介导的烟草转化
• 1.9.4 转基因植株的检测
• 1.9.5 转基因植株的表型观察
• 1.9.6 转基因植株木质素含量的测定
• 1.9.7 转基因植株细胞结构观察
• 2、结果与分析
• 2.1 RNA 的提取及质量检测
• 2.2 百合LsCCR1 基因的克隆
• 2.2.1 目的片段的扩增及回收
• 2.2.2 目的基因3’端cDNA 的分离
• 2.2.3 目的基因5’端cDNA 的分离
• 2.3 LsCCR1 序列分析
• 2.4 LsCCR1 基因的组织表达特异性分析
• 2.4.1 百合总RNA 的提取
• 2.4.2 半定量RT-PCR 方法进行组织表达特异性分析
• 2.5 荧光定量PCR 方法进行
• 2.6 正义表达载体的构建
• 2.6.1 全长cDNA 的分离
• 2.6.2 目的基因与T-载体的连接及转化
• 2.6.3 目的基因与植物表达载体的连接及转化
• 2.6.4 重组子的鉴定
• 2.6.5 重组子转化农杆菌及菌液鉴定
• 2.7 农杆菌介导的烟草转化
• 2.7.1 转基因植株的检测
• 2.7.2 转基因植株的表型观察
• 2.7.3 转基因植株木质素含量的测定
• 2.7.4 转基因植株细胞结构观察
• 3、结论与讨论
• 第四章 东方百合Ls4CL 基因的克隆
• 1、材料与方法
• 1.1 材料及菌株
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 菌株与质粒
• 1.2 百合Ls4CL 基因的克隆
• 1.2.1 总RNA 的提取及鉴定
• 1.2.2 目的片段的分离
• 1.2.3 目的基因3’端cDNA 的分离
• 1.2.4 目的基因5’端的向前延伸扩增
• 1.2.5 目的基因5’端cDNA 的分离
• 1.3 半定量RT-PCR 方法进行组织表达特异性分析
• 1.4 Ls4CL 基因的序列分析
• 1.5 正义表达载体的构建
• 1.5.1 单价Ls4CL 基因的正义表达载体构建
• 1.5.2 双价基因Ls4CL 及LsCCR1 基因的正义表达载体的构建
• 2、结果与分析
• 2.1 百合Ls4CL 基因的克隆
• 2.1.1 目的片段的扩增及回收
• 2.1.2 目的基因3’端cDNA 的分离
• 2.1.3 目的基因5’端的向前延伸扩增
• 2.1.4 目的基因5’端cDNA 的分离
• 2.2 半定量 RT-PCR 方法进行组织表达特异性分析
• 2.3 Ls4CL 基因的序列分析
• 2.4 正义表达载体的构建
• 2.4.1 单价载体的构建
• 2.4.2 双价基因Ls4CL 及LsCCR1 基因的正义表达载体的构建
• 3、结论与讨论
• 第五章 总结
• 1、主要结论
• 2、存在的问题
• 3、进一步的研究方向
• 参考文献
• 详细摘要