十字花科黑腐病菌RNA聚合酶ω亚基的研究

论文摘要

Omega（ω）)亚基是细菌RNA聚合酶（RNA polymerase）最小的一个亚基,尽管它在细菌中广泛存在并且序列非常保守,但由于在许多细菌中编码ω亚基的基因突变后没有明显的表型变化,因此人们通常认为它是不重要的。到目前为止,在大多数细菌（包括动植物病原细菌）中ω亚基的功能还是未知的。十字花科黑腐病菌（Xanthomonas campestris pv.campestris,简称Xcc）,是引起十字花科植物黑腐病的病原菌;它是研究病原细菌与植物之间复杂相互作用的模式菌之一。基因组注释结果表明,十字花科黑腐病菌8004菌株（Xcc 8004）基因组中存在一个编码ω亚基的基因rpoZ（ORF编号为XC0913基因）。为研究ω基的功能,本工作采用自杀质粒pK18mob突变方法,构建了该基因的非极性突变体NK0913。表型检测结果表明:（1）NK0913在丰富和基本培养基上的生长均比野生型菌株明显减慢;（2）NK0913在非寄主植物辣椒ECW-10R上不能产生HR反应而野生型菌株8004在该植物上能产生正常的HR反应,在寄主满身红萝卜上的致病力明显低于野生型菌株8004;（3）NK0913的胞外多糖产量、胞外酶（纤维素酶、蛋白质酶和淀粉酶）的活性、细胞运动能力比野生型菌株显著降低;（4）NK0913在LB培养基中表现为聚集生长而野生型菌株在该培养基中表现为分散生长。将带有完整rpoZ基因的质粒pLALR3导入ω亚基的突变体NK0913后能将该突变体的表型恢复到野生型水平。这些结果表明,ω亚基在Xcc的生长、致病、EPS合成、胞外酶产生、细胞运动、生物膜形成等过程中有重要作用。为了进一步了解ω亚基在上述生理过程中的具体作用,我们用β-葡糖醛酸酶（GUS）活性测定和RT-PCR的方法检测ω亚基与hrp基因的调控关系。GUS报告质粒结果显示,rpoZ基因的突变导致hrp基因簇中hrpB、C、F转录单元以及hrp调控基因hrpG和hrpX的表达明显下降,而RT-PCR结果显示,hrpB5、hpaP、hrcQ,hrpD6、hpaA、hpaB、hpal、hpa2和hrpW基因表达明显下降,但hrpF表达增高。根据这些结果,我们推测ω亚基可能是通过调控hrp基因的表达来影Xcc的致病性和HR反应的。我们还用RT-PCR的方法检测了ω亚基与鞭毛合成相关基因的调控关系。结果显示,rpoZ基因的突变后,鞭毛合成相关基因motA、fliD、fliE、fliL、基因的表达明显下降,表明ω亚基可能是通过调控这些基因的表达来影响Xcc的运动能力。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1.1 植物病原细菌的致病机理
• 1.2 十字花科黑腐病菌简介
• 1.3 十字花科黑腐病菌的致病生化因子
• 1.3.1 胞外多糖（EPS）
• 1.3.2 脂多糖（LPS）
• 1.3.3 胞外酶
• 1.3.4 三型分泌效应物
• 1.4 细菌RNA聚合酶Omega（ω）亚基的研究进展
• 1.4.1 ω亚基的发现和其亚基地位的确定
• 1.4.2 ω亚基在RNA聚合酶中的作用
• 1.4.3 ω亚基的生物学功能
• 1.5 本工作的目的及意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 研究用的材料
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 抗生素和其它药剂
• 2.1.3 植物材料
• 2.1.4 细菌培养基
• 2.1.5 常用溶液与缓冲液
• 2.2 常规微生物学操作
• 2.2.1 培养条件及保存
• 2.2.2 突变体营养缺陷型检测
• 2.2.3 胞外多糖的检测
• 2.2.4 胞外蛋白酶的检测
• 2.2.5 胞外淀粉酶的检测
• 2.2.6 胞外纤维素酶的检测
• 2.2.7 细菌游动性的检测
• 2.2.8 鞭毛观察
• 2.2.9 细菌生物膜的检测
• 2.2.10 Xcc在培养基生长情况测定
• 2.2.11 GUS（β-葡糖苷酸酶）活性检测
• 2.3 分子操作技术
• 2.3.1 DNA分子生物学操作
• 2.3.1.1 质粒的提取
• 2.3.1.2 十字花科黑腐病菌总DNA的提取
• 2.3.1.3 DNA片段的回收
• 2.3.1.4 限制性内切酶酶切
• 2.3.1.5 DNA连接
• 2.3.1.6 琼脂糖凝胶电泳
• 2.3.2 聚合酶链式反应（PCR）
• 2.3.2.1 常规PCR反应
• 2.3.2.2 反转录PCR
• 2.3.3 十字花科黑腐病基因组总RNA的提取
• 2.3.4 细菌的转化与结合实验
• 2.3.4.1 CaCl2转化法
• 2.3.4.2 电脉冲转化法
• 2.3.4.3 细菌的结合实验
• 2.3.5 Xcc 8004基因组上目标基因的整合突变体的构建与互补
• 2.3.5.1 Xcc 8004基因组上目标基因的整合突变体的构建
• 2.3.5.2 突变体的互补
• 2.4 植株试验
• 2.4.1 植株的致病性试验
• 2.4.2 过敏反应
• 2.5 生物信息学分析方法
• 第三章 结果与分析
• 3.1 rpoZ基因的基本特征
• 3.2 rpoZ基因的整合突变体的构建
• 3.2.1 rpoZ基因内部片段的PCR扩增
• 3.2.2 将内部片段克隆到载体pK18mob上
• 3.2.3 突变体的获得及验证
• 3.3 NK0913互补菌株的构建
• 3.3.1 rpoZ基因的PCR扩增
• 3.3.2 将rpoZ基因全基因克隆到载体pLAFR3上
• 3.3.3 互补菌株的获得
• 3.4 ω亚基是Xcc的生长所需要的
• 3.5 ω亚基是Xcc的致病力所需要的
• 3.6 ω亚基是Xcc的HR反应所必需的
• 3.7 ω亚基是Xcc的胞外酶活性和胞外多糖产生所需要的
• 3.7.1 ω亚基是Xcc胞外蛋白酶活性所需要的
• 3.7.2 ω亚基是Xcc胞外淀粉酶活性所需要的
• 3.7.3 ω亚基是Xcc胞外纤维素酶活性所需要的
• 3.7.4 ω亚基是Xcc胞外多糖产生所需要的
• 3.8 ω亚基是Xcc的游动性所需要的
• 3.8 ω亚基与在Xcc生物聚膜形成中存在作用
• 3.9 亚基调控hrp基因和鞭毛相关基因表达的初步研究
• 3.9.1 ω亚基调控hrp基因
• 3.9.2 ω亚基调控部分鞭毛合成相关基因
• 第四章 总结和讨论
• 4.1 ω亚基在Xcc生长中的作用
• 4.2 ω亚基与Xcc胞外酶活性和胞外多糖产生相关
• 4.3 ω亚基是Xcc HR反应产生的必要因素
• 4.4 ω亚基调控Xcc的运动能力
• 4.5 ω亚基对Xcc致病力的影响
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文情况