论文摘要
正畸过程中的牙齿移动与牙槽骨组织的改建关系密切,牙槽骨改建包括骨吸收和骨重建两方面。生理条件下,牙槽骨组织的再生重建是一个由生长因子诱导骨髓间充质干细胞或牙周膜干细胞向成骨细胞分化,而后成骨细胞成熟活化,合成骨基质并最终矿化成骨的复杂生物学过程。在牙槽骨组织再生重建的过程中,体内外各种因素均可影响成骨细胞的增殖和成熟活化。为满足医学临床的应用需求,寻找安全稳定、高效低毒、成本低廉的新型药剂,以促进成骨细胞的增殖和成熟活化进而调控牙槽骨再生的过程正越来越成为口腔医学研究领域的热点。寡核苷酸（oligodeoxynucleotides, ODN）是指含有50个以下核苷酸单体的多核苷酸链。以往的研究表明,ODN可通过受体介导的形式被细胞摄取,内吞进入胞内发挥作用；经磷酸硫代化修饰可增强ODN被细胞摄取与抵抗体内核酸酶消化的能力,增加胞内摄取率并有利于其在体内的稳定。此外,ODN可通过TLR9介导的分子通路调控成骨-破骨平衡,提示ODN可能对成骨细胞分化过程有重要作用。本研究组在前期的研究中已从人工合成的12条不同序列的ODN中成功筛选出2条对骨髓间充质干细胞的增殖及向成骨分化均有作用的ODN。前期研究初步证实特定序列的ODN可以促骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,为进一步研究ODN对成骨细胞增殖与成熟活化的影响提供了重要的理论依据并奠定了实验基础。本研究以前期研究工作为基础,提出了特定序列的ODN能够对成骨细胞增殖和成熟活化发挥调控作用这一科学假设。本研究中所采用的11条ODN均由吉林大学基础医学院分子生物学教研室设计并合成,按其免疫学作用特点可分成三类：（1）具有免疫刺激性的ODN,包括BW001、FC001、BW006、FC002、YW002、FC004和YW001；（2）具有免疫抑制性的ODN,包括SAT05f、MT01和FC003；（3）免疫惰性ODN,比如MS19。本研究通过一系列的体内外生物学实验展开探讨：首先应用体外细胞培养技术获取鼠源性及人源性成骨细胞；采用MTT法和碱性磷酸酶检测等细胞生物学技术,筛选促成骨细胞增殖及活化的寡核苷酸；观察大鼠实验性牙移动模型局部应用特定序列ODN后牙槽骨组织学结构的变化,测量比较实验组和对照组正畸牙移动的距离,采用免疫组织化学染色的方法观察比较骨改建相关蛋白表达的情况：采用流式细胞仪检测特定序列ODN作用于人源性成骨样细胞MG 63后对细胞周期的影响；进一步通过Real Time-PCR、Western blot等分子生物学技术,从转录和翻译水平研究特定序列ODN对体外培养的MG 63细胞骨改建相关因子表达的影响,阐明特定序列的ODN对成骨细胞增殖及成熟活化的影响与作用机制,为ODN用于调控正畸牙移动牙槽骨重建的研究奠定理论基础。本研究具体内容分五部分实验展开：实验1不同ODN对大鼠成骨细胞增殖活性的影响采用Wistar大鼠作为研究对象,原代培养大鼠成骨细胞,茜素红染色鉴定细胞来源。确定细胞最佳铺板浓度后,在实验组细胞中分别加入11条不同序列的ODN,对照组细胞中加入无菌PBS,通过MTT比色法筛选对大鼠成骨细胞增殖具有促进作用的ODN。实验2不同ODN对大鼠成骨细胞成熟活化的影响取传至第3代的大鼠成骨细胞,以每孔5×103个细胞铺96孔细胞培养板,选用实验1中提到的11条不同序列的ODN,等体积无菌PBS液作为对照,分别与上述在96孔板中培养的大鼠成骨细胞共培养72 h后用ALP检测试剂盒检测各组ALP表达水平,同时确定ODN影响大鼠成骨细胞成熟活化的最佳工作浓度。实验3 ODN对实验性大鼠牙移动动物模型骨改建过程的影响通过体内实验探讨经实验1和实验2筛选出的特定序列的ODN对Wistar大鼠实验性牙移动模型的影响。采用形态学观察评价大鼠牙槽骨的组织形态学变化；测量正畸牙移动的距离；采用免疫组织化学染色方法,检测ODN体内作用对骨改建相关因子RANKL、OPG、Runx-2、Osterix和Collagen-Ⅰ表达水平的影响,初步探讨特定序列的ODN在实验性大鼠牙移动模型牙槽骨组织改建过程中的作用及机制。实验4不同ODN对人源性成骨样细胞MG 63增殖活化的影响采用人源性成骨样细胞MG 63作为研究对象,取传代培养至第3代的MG 63细胞,实验组细胞分别与11条不同序列的ODN共培养,对照组中加入等体积无菌PBS液,通过MTT比色法和ALP检测试剂盒筛选对MG 63细胞增殖和成熟活化有影响作用的ODN。实验5 ODN促人源性成骨样细胞MG 63增殖活化作用的机制研究应用流式细胞术检测经实验4筛选出的特定序列ODN作用于MG 63细胞后细胞周期的变化情况；采用Realtime-PCR和Western blot技术定量检测特定序列ODN体外刺激MG 63细胞骨改建相关因子Sp7、Runx-2、Collagen-Ⅰ、RANKL和OPG等基因转录和蛋白表达水平的变化。探讨特定序列ODN促进人源性成骨样细胞MG 63增殖与成熟活化的作用机制。通过上述5部分实验,得出以下结果：实验111条ODNs作用于大鼠成骨细胞24 h后,编号第2、3、6、9、10条ODN可以促大鼠成骨细胞增殖（P<0.05）,作用48 h后,第1、6、9、10条ODN可以促大鼠成骨细胞增殖（P<0.05）；作用72 h后,第1、6、9、10条ODN可以促大鼠成骨细胞增殖（P<0.05）；作用96 h后,第1、2、8、9条ODN可以促大鼠成骨细胞增殖（P<0.05）；其中第9条ODN在整个作用过程中均表现出显著的促增殖作用。实验2与PBS对照组ALP表达量相比,初步筛选出5条ODN（第2,3,8,9,10条）可不同程度刺激大鼠成骨细胞ALP表达水平的上调（P<0.05）。将初步筛选出的第2,3,8,9,10条ODN,以终浓度4.0、2.0、1.0和0.5 mg.L-1分别与大鼠成骨细胞共培养72 h后,进行ALP活性检测,结果发现：ODN工作浓度为4.0和0.5 mg.L-1时,实验组与对照组无统计学差异（P>0.05）,工作浓度为2.0和1.0 mg.L-1时,第9,10条ODN可促进大鼠成骨细胞表达ALP水平显著升高（P<0.05）。实验3局部注射ODN MT01的实验组大鼠第一磨牙牙移动距离均小于对照组（P<0.05）；HE染色光镜下观察可见实验组压力侧牙槽骨吸收破坏的程度较对照组为轻；免疫组织化学染色法检测ODN MT01体内刺激牙槽骨改建相关因子RANKL、OPG、Runx-2、Osterix和Collagen-Ⅰ的表达变化,结果显示实验组OPG、Runx-2、Osterix和Collagen-Ⅰ的表达水平均较对照组增强,而RANKL的表达则有所减弱。实验4 11条ODNs作用于MG 63细胞24 h后,编号第2、3、5、9条ODN可以促MG 63细胞增殖（P<0.05）；作用48 h后,第3、5、6、9、10条ODN可以促MG63细胞增殖（P<0.05）；作用72 h后,第3、5、9、10条ODN可以促MG 63细胞增殖（P<0.05）；作用96 h后,第6、8、9条ODN可以促MG 63细胞增殖（P<0.05）。取第3、5、6、9、10条ODN与MG 63细胞共培养,进行ALP活性检测,发现第9条ODN （ODN MT01）可以促MG 63细胞ALP表达水平显著升高（P<0.05）。实验5采用流式细胞术检测结果显示：与对照组相比,在各个作用时间点（24 h、48 h和72 h）ODN MT01处理组MG 63细胞中处于G1期的细胞比例均明显较空白对照组减少,处于S期、G2期的细胞比例增加；应用实时定量PCR方法,检测ODN MT01作用于MG 63细胞后细胞内成骨相关基因mRNA的表达变化,发现实验组Runx-2、Sp7和collagen-Ⅰ的mRNA表达水平均出现不同程度的增高；应用Western blot技术,检测ODN MT01作用于MG 63细胞后细胞内骨改建相关因子蛋白水平的表达变化,发现与对照组相比,实验组Runx-2、Sp7、collagen-Ⅰ和OPG的表达均出现不同程度的增高,而RANKL的表达出现了明显的降低。通过以上实验结果,可以得出以下结论：结论1所选11条ODNs中有3条特定序列的ODN,第6、9、10条（ODN BW006, ODN MT01, ODN YW001）,可以促进体外培养的大鼠成骨细胞的增殖；其中第9条ODN （ODN MTO1）在整个作用过程中均表现出显著的促增殖作用。结论2工作浓度为2.0和1.0 mg.L-1时,第9,10条ODN （ODN MT01, ODNYW001）可促进体外培养的大鼠成骨细胞的成熟活化。结论3ODN MT01能够在体内调控大鼠实验性牙移动模型牙槽骨的改建,抑制大鼠实验性牙移动,有效保护牙槽骨结构的完整性,防止破坏性骨吸收的发生。结论4ODN MT01对体外培养的人源性成骨样细胞MG 63同样具有显著的促增殖及促成熟活化的作用。结论5ODN MT01能够影响MG 63细胞的细胞周期,通过促使细胞进入S期使MG 63细胞的增殖活性增强；ODN MT01可能通过增加MG 63细胞中Runx-2、Sp7和Collagen-Ⅰ等成骨相关因子的表达水平进而促进MG 63细胞的增殖和成熟活化；ODNMT01可能通过上调OPG同时抑制RANKL的表达水平,增加OPG/RANKL的比值,经OPG-RANK-RANKL信号通路调控了成骨细胞的增殖与成熟活化的过程。
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